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瘦素对血管内皮细胞ECV-304缺氧/复氧损伤的保护作用
探讨外源性瘦素(Leptin)对血管内皮细胞ECV-304缺氧/复氧(H/R)损伤保护作用及其作用机制.建立人脐静脉(ECV-304)内皮细胞缺氧/复氧损伤模型,观察不同的缺氧和复氧时间对内皮细胞的损伤作用.设立正常对照组、损伤组、干预组,每组6例;利用试剂盒测定乳酸脱氢酶、丙二醛和超氧化物歧化酶的释放量;四唑盐比色法(MTT)测定血管内皮细胞的存活率.结果显示,单纯缺氧组和缺氧/复氧组均可见细胞变圆、收缩、脱落;细胞死亡率较正常组增加;细胞上清中丙二醛(MDA)与乳酸脱氢酶(LDH)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)含量降低;缺氧/复氧组较单纯缺氧组损伤更加明显,与正常培养组相比具有显著意义(P＜0.05).Leptin晚期预处理后,细胞形态基本上保持正常,上述检测指标与缺氧/复氧组相比有显著意义(P＜0.05).并且50μg/L Leptin的保护作用为明显.表明Leptin对ECV-304细胞缺氧/复氧损伤的保护作用具有剂量依赖性.
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β-七叶皂苷钠抗大鼠主动脉血管形成作用及机制初探
目的:研究β-七叶皂苷钠对血管形成的作用及其作用机制.方法:采用大鼠主动脉片96孔板培养,检测β-七叶皂苷钠对体外血管形成的影响;采用MTT法研究β-七叶皂苷钠对ECV-304细胞增殖的影响;采用免疫组织化学法研究β-七叶皂苷钠对小鼠S180肉瘤内血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.结果:β-七叶皂苷钠50μg·mL-1组在d1～d5对大鼠主动脉片血管出芽发生率有明显的抑制作用,抑制率均＞39.0%;在d 2～d 6大鼠主动脉片血管相对面积明显小于阴性对照组,抑制率均＞68.9%.MTT实验证明β-七叶皂苷钠对ECV-304细胞增殖具有明显抑制作用:100 μg·mL-1抑制率为70.3%,50μg·mL-1抑制率为53.6%;免疫组织化学实验β-七叶皂苷钠1.4和2.8 mg·kg-1组VEGF表达量均明显少于生理氯化钠溶液对照组.结论:β-七叶皂苷钠具有抑制血管形成的作用,其发挥作用的可能机制是抑制血管发生、内皮细胞的增殖及VEGF的表达.
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偏硅酸钠对ECV-304细胞株与单个核细胞黏附的影响
目的 观察偏硅酸钠(Na2SiO3)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的ECV-304细胞与人外周血单个核细胞黏附的影响,探讨其抗动脉粥样硬化(AS)作用的机制.方法 ECV-304细胞分为5组:对照组、ox-LDL组、Na2SiO3高剂量组(硅68.5 mg/L)、中剂量组(硅34.2 mg/L)、低剂量组(硅17.1 mg/L).分离正常健康人外周血单个核细胞,计数与各组ECV-304细胞黏附数,检测细胞培养液中IL-8水平;采用流式细胞术测VCAM-1的蛋白表达量;半定量RT-PCR检测VCAM-1、IL-8mRNA的表达.结果 Na2SiO3减少ECV-304单个核细胞黏附数(P＜0.01),降低IL-8浓度(P＜0.01),降低VCAM-1的蛋白表达量(P＜0.05),下调VCAM-1、IL-8 mRNA的表达(P＜0.01).结论 Na2SiO3能够下调ox-LDL诱导的ECV-304 IL-8和VCAM-1的表达.
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激光共聚焦显微镜在细胞内ROS研究中的激光干扰问题
目的 对激光共聚焦显微镜在细胞内ROS研究中的激光干扰问题进行探讨.方法 ROS探针标记ECV-304及BAW264.7细胞后,激光共聚焦显微镜488nm波长检测器分别进行连续和间隔观测1200s,比较两种观测方式下细胞荧光强度的变化;外源性加入H2O2,证实间隔观测时系统的灵敏性.结果 在连续观测方式下,细胞荧光强度短时间内显著增强,改为间隔观测后细胞荧光强度变化缓慢,但维持在低水平且在外源性加入H2O2后细胞荧光强度迅速增强.结论 激光共聚焦显微镜激发激光可引起细胞大量产生ROS,对检测系统造成干扰,采用间隔观测的方法可显著改善系统自身的这种缺陷,并能保持系统的检测灵敏性.
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高血压病血淤证患者血清对人脐静脉内皮细胞株分泌NO、ET的影响及丹参酮ⅡA的干预作用
目的 观察高血压病血淤证患者血清对人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)分泌NO,ET的影响及丹参酮ⅡA(TanⅡA)的干预作用.方法 硝酸还原酶法检测细胞分泌的一氧化氮(NO)浓度,非平衡法测定细胞分泌的内皮素(ET);观察不同浓度丹参酮ⅡA对细胞分泌NO,ET的干预作用.结果 血淤组分泌的NO低于对照组、健康组,且差异显著(P<0.05或P<0.01);血淤组分泌的ET高于对照组、健康组、非血淤组,且差异显著(P<0.05或P<0.01);TanⅡA40,20μg/ml剂量组分泌的NO较血淤组低,10,5μg/ml剂量组分泌的NO较血淤组高,但均无显著差异;TanⅡA40,20,15,5 μg/ml剂量组分泌的ET较血淤组低,其中40,20 μg/ml剂量组无显著差异,10,5 μg/ml剂量组有显著差异(P<0.01).结论 血淤证患者血清可损伤培养的内皮细胞,引起其内分泌功能发生改变,TanⅡA具有保护内皮细胞的功能.
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脂质体介导NF-кB decoy ODN低温缺氧对ECV-304的转染及复氧后对下游粘附分子及趋化因子基因表达的影响
目的探讨在Euro-Collin's(ECs)中,低温(4℃)缺氧条件下脂质体(in v1vo Liposome)介导N F-κ B诱捕物寡核苷酸(NF-κ B decoy ODN)对人脐静脉内皮细胞株(ECV-304)的转染效率以及复氧后对其细胞分子表达的影响.方法ECV-304在10%FBS的RPMI 1640培养液,37℃、5%CO2条件下培养,生长至单层融合后进行试验.使用前配制Liposome/decoy ODN和scrambled ODN复合物,Liposome与ODN的+/-电荷比率为2.应用荧光显微镜和流式细胞仪,观察在4℃条件下,ODN浓度1.0μM的ECs缺氧保存6h后ECV-304的平均荧光强度(MFI)和摄取率以及ODN的胞内分布;同时设立裸ODN转染为对照,观察Liposome介导ODN对ECV-304的转染效率.利用RT-PCR方法检测各组ECV-304的ICAM-1、VCAM-1、IL-8、MCP-1以及P-selectin的mRNA表达.结果在ECs中、4℃缺氧保存ECV-304 6h后,LiPosome介导ODN对ECV-304转染的MFI为10172.71±33.14,是裸ODN转染的91.1倍,细胞对ODN的摄取率为93.06±2.60%,是裸ODN转染的71 5倍.Liposome介导ODN转染的ECV-304,荧光显微镜下可见部分荧光颗粒分布于胞浆,胞核内可见强荧光颗粒;而裸ODN转染的ECV-304,胞浆内偶见少量荧光,胞核内未见荧光颗粒RT-PCR检测显示Liposome/decoy ODN转染ECV-304后,其ICAM-1,VCAM-1,IL-8,MCP-1以及P-selectin的mRNA的表达低于未转染组和Scramb.ODN转染组,有显著性差异.结论低温缺氧条件下和ECs中,Liposome能有效地将ODN转染到ECV-304的胞核中,而裸ODN则不能进入细胞;经Liposome/decoy ODN处理的ECV-3 04,其下游粘附分子及趋化因子的基因表达被抑制.
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发卡样NF-κB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究
目的采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,通过构建人NF-κB p65基因的特异性siRNA真核表达载体,体外观察对NF-κB基因的沉默作用,以及对内毒素(LPS)刺激后NF-κB活性的调控作用.方法采用基因克隆技术,将合成的发卡样特异性p65 RNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体(pPUR/U6),构建p65 siRNA的表达载体,转染体外ECV-304细胞,48h后观测胞内NF-κB p65亚单位蛋白水平(Western blotting)、及对LPS(10 μg/ml)刺激后NF-gB活化的抑制作用.结果①成功构建发卡样p65 siRNA(small interfere RNA)真核表达载体(pPUR/U6-p65 siRNA);②pPURyU6-p65 siRNA转染(脂质体法)ECV-304细胞,48 h后明显下调胞内P65蛋白水平;③转染pPUR/U6-p65 siRNA的细胞,明显抑制LPS(10μg/ml)刺激后NF-κB的活化.结论该RNA干扰真核表达载体能明显干扰p65蛋白的表达、释放,进而抑制NF-κB的活化,可望进一步抑制细胞的过度炎症反应,减轻创伤组织的受损程度,促进创伤后组织的修复.
