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组分复方“CKJ”药物血清对大鼠原代肝星状细胞活化和转化生长因子β1及其受体的影响
目的 探讨由虫草多糖、苦杏仁苷、绞股蓝总皂苷组成的“CKJ方”药物血清对大鼠原代肝星状细胞(primary hepatic stellate cells,rHSCs)活化的影响及相关药理作用机制.方法 分离并培养rHSCs,将培养4天的rHSCs分为正常组、模型组及CKJ组.模型组及CKJ组以2.5 ng/mL转化生长因子β1 (TGF-β1)刺激造模24 h,正常组以不合TGF-β1的基质液(无血清的DMEM)作为对照.药物组以5％CKJ方药物血清继续孵育24 h,正常组及模型组以5％空白血清孵育24 h.采用细胞高内涵筛选技术(HCS)免疫荧光法及Western blot检测rHSCs α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、血小板源性生长因子β受体(PDGF-βR)、TGF-β1、转化生长因子β受体1(TGF-βR1)、转化生长因子β受体2(TGF-βR2)mRNA的表达水平.结果 与正常组比较,模型组rHSCs α-SMA蛋白表达及α-SMA、Col-Ⅰ、PDGF-βR、TGF-f1、TGF-βR1、TGF-βR2mRNA表达水平明显升高(P＜0.05,P＜0.01);与模型组比较,5％ CKJ药物血清组rHSCs α-SMA蛋白表达及α-SMA、Col-Ⅰ、PDGF-βR、TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2 mRNA表达水平明显降低(P＜0.05,P＜0.01).结论 组分复方“CKJ”药物血清可降低大鼠rHSCs α-SMA的蛋白表达,其主要作用机理可能与抑制TGF-β1及其相关受体有关.
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大黄虫丸对大鼠原代肝星状细胞BAMBI表达的影响
目的 通过检测大鼠原代肝星状细胞(HSC)中骨成形蛋白-激活素膜结合阻断因子(BAMBI)的表达,探讨大黄虫丸抑制及逆转肝纤维化的作用机制.方法 采用清洁级Wistar大鼠,成功复制大鼠肝纤维化模型,分离培养在体大鼠原代HSC,分为正常组、模型组和大黄虫丸组.培养24 h后,采用实时荧光定量PCR法检测原代HSC细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、BAMBI的基因表达变化,采用免疫组化、蛋白质印迹法(Western blot)检测原代HSC中蛋白的表达变化,采用凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测各组细胞核因子κB(NF-κB)的活性.结果 在大鼠原代HSC中,与正常组比较,大黄虫丸组和模型组TLR4、MyD88蛋白及基因的表达增强(P<0.05、P<0.001),BAMBI蛋白及基因表达降低(P<0.001);与模型组比较,大黄虫丸组TLR4、MyD88蛋白及基因的表达降低(P<0.05),BAMBI蛋白及基因表达增强(P<0.05).EMSA结果显示:与正常组比较,模型组HSC核转录因子NF-κB的活化增强;与模型组比较,大黄虫丸组NF-κB的活化受抑制.结论 大黄虫丸可以改善肝纤维化.其作用机制可能是降低肝星状细胞TLR4、MyD88的表达,抑制HSC核转录因子NF-κB的活化,进而增加BAMBI的表达,降低HSC对转化生长因子-β(TGF-β)的敏感性,从而改善肝纤维化.
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晚期糖基化终产物受体特异性小干扰RNA对致纤维化细胞因子生成的抑制作用
目的 晚期糖基化终产物受体(the receptor of advanced glycation end products,RAGE)特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能在肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)T6内抑制RAGE、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达,其在HSCs的激活和胶原的形成中发挥着重要的作用.探讨RAGE特异性siRNA在原代大鼠HSCs中对致纤维化细胞因子生成的影响.方法 构建RAGE特异性siRNA表达载体,分离培养原代大鼠HSCs,将重组载体转染入原代大鼠HSCs,以空白组和转染非特异性siRNA表达载体pAKD-NC组为对照,分别用PCR法和Western blot检测各组原代HSCs RAGE、β1转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)mRNA及蛋白的表达.结果 转染特异性siRNA表达载体pAKD-GR126的原代HSCs RAGE mRNA和相对分子质量为42000的RAGE蛋白的表达分别为空白组和pAKD-NC组的(42.32±6.16)%、(43.24±7.50)%和(51.06±13.79)%、(47.94±5.36)%,差异有统计学意义(P<0.05).同时TGF-β1 mRNA和蛋白的表达率分别占空白组和pAKD-NC组的(43.72±0.76)%、(44.75±3.78)%和(45.35±2.03)%、(47.71±3.32)%(P<0.05),CTGF mRNA和蛋白的表达分别是空白组和pAKD-NC组的(39.32±7.22)%、(39.50±4.58)%和(42.58±5.95)%、(43.74±2.16)%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 RAGE特异性siRNA可抑制原代大鼠HSCs RAGE基因的表达,并能有效抑制致纤维化细胞因子的生成.
