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DNA条形码技术在常见中药材蛇类鉴别中的应用
中药材的准确鉴别是中药材研究、生产和应用至关重要的一步.DNA条形码技术以线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因序列作为标记,在中药材鉴别中的应用日益增多.研究应用DNA条形码通用引物扩增测序,探讨DNA条形码技术在常见中药材蛇类(6科15属19种共109个样品)鉴别的可行性,采用邻接法构建该类群分子系统发育树.结果表明,该片段的G+C平均量为43.9％,低于A+T平均量(56.1％).基于Kimura双参数模型计算,白唇竹叶青、乌梢蛇和赤练蛇的种内平均遗传距离均大于2％.通过构建系统发育关系后进一步分析发现,白唇竹叶青一样品鉴别有误.乌梢蛇中的某些样品也可能存在鉴别有误,即原本是灰鼠蛇的可能被错误鉴定为乌梢蛇.造成赤练蛇种内遗传距离差异大的因素需进一步分析.DNA条形码用于常见中药材蛇类种间的鉴别是可行的,极大程度地弥补统形态学分类方法的缺陷,值得加大推广应用和进一步深入研究.
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特异性PCR方法鉴别蛇胆汁及其伪品
建立一种简便准确的蛇胆汁药材DNA分子鉴别方法.测试并优化胆汁药材基因组DNA提取方法,并针对蛇类的COⅠ,Cyt b,16S基因序列设计4对蛇类鉴别引物,根据特异性和扩增效率筛选佳引物.使用其中1对引物Cytb1,20种蛇胆汁DNA均能扩增得到约400 bp的条带,同样条件下7种其他动物胆汁DNA均无扩增条带.该方法特异性强,准确度高,重复性好,为加强控制蛇胆汁药材质量提供了有效方法.
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中药穿山甲的DNA分子鉴定研究
对中药穿山甲及其混伪品进行分子鉴定研究,建立一个稳定、准确的位点特异性PCR鉴别体系.收集整理穿山甲属动物组织样本及NCBI序列,提取基因组总DNA,PCR扩增Cytb和COⅠ序列并测序,通过BioEdit软件进行序列比对,应用MEGA6.0构建序列系统聚类树,并根据序列特异位点设计和筛选中华穿山甲特异性鉴别引物,并对PCR反应条件进行退火温度、DNA模板上样量和PCR循环数等条件的适应性考查.结果表明:Cytb和COⅠ序列均能有效对穿山甲正、伪品进行聚类分析;在位点特异性PCR反应体系中,当退火温度为55~60℃,DNA模板量3~100ng,PCR扩增35个循环时,基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能使中华穿山甲扩增出约400bp的特异性条带,而其他穿山甲品种扩增结果为阴性.该文基于COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能实现中华穿山甲与伪品印度穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲等的准确、稳定鉴别.
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基于线粒体COⅠ基因序列进行库蠓亚属(双翅目:蠓科)近似种的分子鉴定
为了更快速、 准确地鉴别库蠓近似种以及弥补传统形态学在种类鉴定中存在的操作繁琐、 难度大等不足,本文采用DNA测序的方法获得库蠓亚属的刺螫库蠓Culicoides punctatus、 灰黑库蠓C.pulicaris和新替库蠓C.newsteadi等3种库蠓近似种的部分线粒体COⅠ基因序列,并对其进行分子鉴定;基于Kimura 2-parameter模型分析遗传距离,同时应用MEGA 6.0软件构建系统发育树.结果显示,序列经过Clustal W比对及人工校对后,上述3种库蠓的COⅠ序列长度为394 bp;遗传距离在种内和种间具显著差异(P﹤0.05);系统发育树中不同库蠓种类各自构成单系(群),同种类不同地理种群聚为一支.本研究初步证实了线粒体COⅠ序列可应用于库蠓近似种的分子鉴定.
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海峡两岸荒川库蠓亲缘地理学研究
以COⅠ、16S rDNA和ITS基因为标记,选用环斑库蠓Culicoides circumscriptus(N267)作为外群,对海峡两岸10个群体77个荒川库蠓标本的遗传距离、 基因分化、 系统发育和种群结构进行分析.基于COⅠ、16S rDNA基因数据集及ITS基因数据集的AMOVA分析均显示,大的遗传变异主要来自种群内的遗传变异,在线粒体数据集及核糖体数据集的比例分别为96.75％和91.44％.不同基因的分子数据显示,不同种群间的荒川库蠓遗传分化程度低、 基因交流频繁,各个地理种群没有按照地理区划形成独特的遗传结构.气流及人为因素可能是造成其远距离扩散的主要原因.
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吸血蠓分子分类研究进展
随着分子生物学技术的发展,分子系统学相关技术日臻完善,在物种分类研究中已经取得了很多令人瞩目的 成就,引起越来越多学者的广泛关注.分子分类技术作为一种新的物种鉴定手段,可以弥补传统分类技术的不足,可有效区分近缘种、隐种,并在物种种群进化、起源及亲缘关系的研究中显示出广阔的应用前景.本文综述了吸血蠓的分子分类研究进展,对几个常用标记基因的应用进行了介绍.
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广西两地异盘并殖吸虫的系统发生研究和分类地位探讨
目的:研究广西两地(灵川、那坡)异盘并殖吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS2)和线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ基因(COⅠ)序列,探讨它们的分类学地位.方法:采集广西灵川和那坡两地的异盘并殖吸虫囊蚴接种大鼠,获得成虫后提取基因组DNA, PCR扩增其ITS2和COⅠ基因并测序.测得序列与从GenBank获得的其他地区异盘并殖吸虫的相关基因序列进行同源性分析,并以小进化法和大简约法构建系统发生树.结果:广西那坡异盘并殖吸虫种群与泰国种群的基因同源性很高(99%～100%),与广西灵川种群的同源性稍低(97.4%～100%).构建的系统发生树显示,中国广西那坡、泰国、越南种群同属一个支系,中国广西灵川种群则位于另一分支.结论:广西灵川和那坡两地的异盘并殖吸虫为同一虫种,但可能为不同地理株.
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四川宜宾产桃花水母的线粒体CO I序列片段分析
目的：针对桃花水母形态分类中存在的一些混乱和矛盾，引入分子生物学方法阐明其分类难题。方法：采用PCR和DNA测序技术，对四川宜宾产桃花水母标本的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）片段进行了扩增与测序，并与GenBank中已有的淡水水母目COⅠ基因序列进行比对分析，利用MEGA 5计算它们的遗传距离，构建NJ树。结果：该桃花水母标本与索氏桃花水母Craspedacusta sowerbii的COI基因相似度极高，同源性在99%以上，遗传距离为0.003，在进化树中与索氏桃花水母聚为同一支。结论：该标本属于索氏桃花水母。
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贵阳地区常见尸食性蝇类mtDNA分子标记的检测
目的 应用mtDNA中COⅠ (348bp)、COⅡ (637bp)及16SrDNA (513bp)基因序列鉴定贵阳地区常见尸食性蝇类的种属.方法 收集贵阳地区常见尸食性蝇类标本,经形态学分类鉴定后提取胸肌DNA,扩增COⅠ (348bp)、COⅡ (637bp)及16SrDNA (513bp)基因片段,测序后用DNAMAN 4.0序列分析软件进行序列拼接,NCBI中的BLAST、MEGA 5.2软件包对所得序列分析建立种内及种间进化分歧率,并构建系统发育树.结果 COⅠ种间平均进化分歧率为12.55％,种间范围在3.0％ ～ 18.6％,种内范围在0％ ～0.7％;COⅡ种间平均进化分歧率为13.73％,种间范围在5.3％ ～21.6％,种内范围在0％ ～0.6％;16SrDNA种间平均进化分歧率为4.54％,种间范围在0.4％～7.6％,种内范围在0％～0.4％.结论 COⅠ、COⅡ及16SrDNA可用于尸食性蝇类的种属鉴定,该方法可作为传统分类方法的补充手段.
