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依托实训基地教学平台培养学生综合实践能力的研究
为了提高学生综合实践技能,加强学生独立分析问题、解决问题的能力,达到从学校到医院的“无缝对接”,依托实训基地设计了综合性实验.方法以制备抗血清为主线,让学生亲自动手操作,同时将制备的抗血清应用于实验教学,通过凝集反应、沉淀反应检测自制抗血清的效价,同时将制备的抗血清应用于后续的实验教学.结果建立了以创新能力培养为核心的综合性实验教学模式.结论提高了学生动手能力,独立分析问题、解决问题的能力.探索出一种富有活力、具有创新激情的实验教学模式.
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小鼠野生型和突变型透明质酸受体RHAMM的抗血清制备及其初步应用
目前,小鼠第11号染色体的 RHAMM(Receptor of Hyaluronic Acid Mediated Motility)基因的研究多限于体外或啮齿类动物实验系统,有关该基因在人癌组织中的表达形式及其肿瘤生物学意义仍所知甚少.利用多种分子生物学技术,制备针对RHAMM 的生物/免疫试剂将会推动这方面研究的进展.
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在制备尖吻蝮蛇毒出血毒素抗血清中不同凝胶染色方法的比较
目的：：寻找在制备出血毒素抗血清中电泳后染色凝胶的好方法。方法：按照前人的方法从皖南产尖吻蝮蛇毒中初步分离3种出血毒素：AaHⅠ、AaHⅡ和AaHⅣ并获得3种粗提取的出血毒素,用制备电泳的方法进一步纯化AaHⅠ、AaH Ⅱ和AaH Ⅳ,对每种出血毒素,配制6块制备电泳板并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,用6种不同的染色方法分别染色,将含出血毒素的凝胶切下,磨细后直接免疫注射小鼠并获得抗血清,用ELISA检测和中和出血毒素出血活性两种方法检测抗血清的质量。结果：不同染色方法制备的抗血清中有效IgG浓度不同,用无毒型蛋白质快速染色试剂盒染色制备的抗血清有效IgG浓度高。结论：用无毒型蛋白质快速染色试剂盒染色是制备抗血清好的染色方法。
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肝癌特异性γ-GT纯化及抗血清制备
以生化技术从人肝癌组织中提取纯化出肝癌特异性γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTⅡ),并以此酶为抗原免疫新西兰兔,制备抗γ-GTⅡ血清.应用免疫双扩散法对该抗血清的特异性进行检测.结果显示此抗血清与人肝癌γ-GTⅡ抗原及原发性肝癌患者血清均具有很好的特异性免疫反应.
关键词： 肝癌特异性γ-GTⅡ 抗血清制备 原发性肝癌 -
E.coli O157∶H7鞭毛蛋白H7抗原的表达纯化及抗血清的制备
应用生物信息学分析工具对E.coli O157∶ H7鞭毛蛋白H7抗原(flic 基因)表位进行分析,筛选抗原表位较富集的片段;优化基因序列,使其适合在原核载体中表达并化学合成序列.构建重组质粒pGEX-4T-2-flic和pET28a(+)-flic,转化E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导蛋白表达,分别用GST胶亲和层析技术和金属螯合层析技术纯化GST标签和His标签的目的蛋白,获得了高纯度的GST-Flic和His-Flic.使用His-Flic抗原免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测体液免疫效价,兔颈动脉取血并离心制备获得兔抗血清.纯化的两种蛋白和制备的兔血清多抗为研制E.coli O157∶H7检测试剂奠定了基础.
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侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(FVY)CP基因的原核表达及抗血清制备
目的:制备抗侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(Fritillary virus Y,FVY)CP血清,为大田检测FVY和研究FVY与其他病毒之间的血清学关系奠定基础.方法:根据Genbank报道的FVY CP基因序列设计引物,扩增其CP基因.Blast分析FVY CP基因核苷酸序列与其他马铃薯Y病毒属成员CP基因的同源性.将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21 (DE3) Plys E菌株,通过IPTG诱导表达.经12％ SDS-PAGE和5％ - 20％梯度SDSPAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性.用原核表达的17种马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白作为抗原,检测抗FVY CP血清是否能与其进行交叉反应.采用ELISA分析抗体能否与天然FVY病毒离子结合.结果:FVY CP基因与油点草病毒Y(TrVY)CP基因、大豆花叶病毒半夏分离物CP基因和小西葫芦黄花叶病毒六安分离物CP基因分别有81.2％、68.1％和67.2％的同源性.制备的抗体对FVY CP具有高度特异性,同时能与大豆花叶病毒半夏分离物(SMV-P)CP蛋白有中等强度的结合,与小西葫芦黄花叶病毒CP蛋白有弱的结合.结论:抗体能够与天然FVY病毒离子结合,因此可以作为该病毒的大田检测.
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抗流感病毒血清的制备
目的:制备抗流感病毒血清为所分离的流感病毒亚型分型和鉴定之用.方法:用灭活流感病毒免疫家兔,使其产生抗体,收集兔血清,测定抗血清的血凝抑制效价以判定血清的抗体滴度.结果:抗H5N1血清和抗H6N1血清效价高且与其它病毒抗原不产生交叉反应,抗H9N2(Y280)和抗H9N2(G1)两种血清彼此间有较明显的交叉反应,可能与两者血凝素结构未发生变化有关,故这两种血清均可应用于H9N2病毒的鉴定.结论:本方法制备的抗流感病毒血清效价高,交叉反应小,可作流感病毒的亚型分型及鉴定之用.
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氨基端PLCε基因的克隆、原核表达及抗血清的制备
目的 通过在原核系统中表达人磷脂酶Cε (phospholipase Cε,PLCε)基因,制备兔抗PLCε的抗血清,并验证其特异性.方法 应用RT-PCR从人膀胱癌细胞的cDNA中克隆出部分PLCε基因,构建重组表达载体PGEX-6P-1/PLCε,并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导表达GST-PLCε融合蛋白,通过GST亲和层析系统纯化重组蛋白,超滤后免疫家兔,获得家兔抗PLCε的抗血清.采用ELISA检测抗血清效价,Western blot测定其特异性.结果 RT-PCR扩增出336 bp的PLCε基因,并成功构建重组质粒PGEX-6P-1/PLCε,质粒测序结果显示,目的基因序列与GenBank中PLCε基因序列完全一致.将纯化后的GST-PLCε蛋白免疫家兔,获得抗血清；ELISA效价1∶16 000以上；Western blot结果显示,该抗血清与原核表达的GST-PLCε融合蛋白和人膀胱癌T24细胞株表达的PLCε蛋白特异性结合.结论 在原核细胞中表达了PLCε蛋白,制备了家兔抗人PLCε的抗血清,可用于相关肿瘤检测,为进一步研究PLCε蛋白功能和作用机制奠定了基础.
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卵巢癌相关抗原CA125串联重复序列的原核表达纯化及抗血清制备
目的:建立CA125串联重复序列(CA125R)原核表达系统,表达纯化重组CA125R蛋白并制备其抗血清.方法:全基因合成一段CA125串联重复序列,并将其克隆至pET-32a(+),构建CA125R蛋白原核表达载体pET-CA125R；将构建好的pET-CA125R载体转化至E coli BL21(DE3),确定佳可溶性表达条件,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组CA125R蛋白；纯化重组蛋白经Western blot方法验证后,免疫家兔制备抗血清.结果:成功构建CA125串联重复序列原核表达载体,确定了佳可溶性诱导表达条件(0.5 mmol/LIPTG,15℃诱导6h)；Western blot结果证实纯化的重组蛋白正确,纯度高；制备的抗血清能特异识别重组CA125R蛋白和天然CA125糖蛋白.结论:成功建立了CA125R高效原核表达系统,并制备了高纯度重组CA125R蛋白及其抗血清.
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小鼠visfatin抗体的制备及应用
目的: 制备高效价抗visfatin抗体, 探测visfatin在前脂肪细胞成脂分化过程中在空间上表达情况.方法: 克隆鼠内脂素visfatin基因的蛋白编码区全长序列, 构建其原核表达载体pET28a-visfatin, 然后在E.coli(BL21)中诱导大量以包涵体形式表达, 提取包涵体并用Ni-NTA 亲和层析柱纯化蛋白, 并以此为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.以纯化后的抗血清为一抗, Western blot检测小鼠肝、肌肉等组织中visfatin的分布.结果: SDS-PAGE及Western blot显示原核表达载体pET28a-visfatin在大肠杆菌中诱导表达, 融合蛋白能够被抗his mAb识别.免疫新西兰大白兔获得抗体效价在1∶ 25 600以上.结论: 用制备得到的抗体对小鼠心、肝、肺、脾、脂肪、肌肉组织样品做Western blot鉴定, 结果表明visfatin在各组织中均有表达, 其中脾和脂肪组织中表达量高于其他组织.
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小鼠Foxp3抗血清的制备及应用
目的:制备高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清,并初步应用于正常小鼠组织的Foxp3表达的鉴定.方法:构建重组质粒pGEX-6p-2/Foxp3,并转化至E.coli BL21(DE3)中进行大量诱导表达,用纯化的重组融合蛋白免疫新西兰兔,制备抗血清.以制备的抗血清为一抗,Western blot检测小鼠组织的Foxp3蛋白的表达.结果:SDS-PAGE及Western blot鉴定,诱导表达及纯化的重组融合蛋白能被抗GST单克隆抗体(mAb)识别,在Mr 45 000附近有特异条带,与预期融合蛋白大小一致,获得的抗血清效价在1:12 800以上,该抗血清能特异性识别NIH3T3细胞中表达的Foxp3蛋白.Western blot鉴定结果显示在脾脏、胸腺、淋巴结中Foxp3蛋白有较高表达,胃也有少量的表达,而骨骼肌、脂肪组织未见表达.结论:制备了高效价的特异性小鼠Foxp3抗血清,并可用于正常小鼠组织的Foxp3蛋白的表达鉴定,为进一步研究Foxp3奠定了实验基础.
关键词： FOXP3 CD4+CD25+Treg细胞 抗血清制备 -
兔抗吗啡多克隆抗体制备
先将吗啡在6-羟基位改造为6-琥珀酰吗啡,再通过碳二亚胺将其与牛血清白蛋白或卵蛋白胶连分别制备免疫原和检测原,免疫新西兰大白兔制备出高效价(1:12800)抗吗啡多克隆抗体,为进一步制备抗吗啡单克隆抗体奠定基础.
