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乌头和“半蒌贝及”配伍对甲醛致痛模型小鼠镇痛作用的影响
目的:考察“半萎贝及攻乌”反药组合对制川乌镇痛效果的影响并探索相关机制.方法:基于甲醛足底皮下注射致病模型,检测致痛小鼠给药后2个时相的舔足时间,明确制川乌和法半夏、栝楼、川贝母、浙贝母、白及各单药及1∶1、1∶2和1∶3配伍组合的镇痛效果,并通过联用κ阿片受体激动剂U-69593或拮抗剂Nor-BNI以及ELISA检测致炎足NO、PGE2和TNF-α含量方法,进一步分析相关作用机制.结果:制川乌单用能明显缩短致痛小鼠2个时相的舔足时间,配伍法半夏、栝楼、浙贝母和白及后此作用减弱,呈量效关系.制川乌联用Nor-BNI后可使舔足时间延长至不给药的状态;联用U-69593后舔足时间比之前缩短,再配伍法半夏、白及后舔足时间明显延长;制川乌单用能明显降低甲醛致痛小鼠炎症足中NO、PGE2和TNF-α的含量,配伍法半夏、栝楼、浙贝母和白及后相关因子含量升高.结论:降低乌头的镇痛功效可能是“半蒌贝及攻乌”反药组合相反的具体表现之一,其机制与干扰κ阿片受体活化及增高炎症局部促炎介质含量有关.
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不同剂量喷他佐辛抑制吗啡的镇痛作用
目的:研究不同剂量喷他佐辛对吗啡镇痛效果的影响及可能机制.方法:60只C57BL/6J小鼠随机分为10组(n=6),其中5组喷他佐辛注射前2小时预先注射生理盐水,另外5组预先注射kappa受体拮抗剂nor-BNI(10 mg/kg),随后各组同时皮下注射不同剂量喷他佐辛(0、10、30、56、100 mg/kg)和吗啡(10 mg/kg),分别于药物注射前和注射后30、60、90、120 min对小鼠进行机械痛阈(压尾试验)和热痛阈(热板试验,甩尾试验)测定,并分别计算药物时效的曲线下面积(area under curve,AUC)作为药物镇痛效应的量化指标.结果:①不同剂量喷他佐辛(0、10、30、56、100 mg/kg)在与吗啡合用后的压尾AUC分别为(244.1±19.5)、 (166.5±9.6)、(146.6±8.3)、(130.7±7.8)、(124.5±10.1)(gh);热板AUC分别为(27.9±4.0)、(24.4±1.6)、(22.8±1.6)、(23.3±2.1)、(22.7±1.2) (s·h);甩尾AUC分别为(13.1±1.9)、(12.0±1.7)、(10.4±0.8)、9.5±0.9)、(9.7±1.3)(s·h).这提示喷他佐辛可剂量依赖地抑制吗啡的镇痛作用.②使用κ受体拮抗剂nor-BNI后,不同剂量喷他佐辛(0、10、 30、56、100 mg/kg)与吗啡合用后的压尾AUC分别为(252.2±16.7)、(167.7±11.0)、(145.1±9.8)、(132.6±5.1)、(127.3±8.0)(g·h);热板AUC分别为(28.0±1.7、 (25.0±1.6)、 (23.0±1.2)、 (22.0±1.4)、 (21.2±1.3)(s·h);甩尾AUC分别为(14.4±1.8)、 (11.2±1.4)、 (10.2±0.8)、(9.7±0.7)、(10.1±0.8)(s·h),与上述未使用nor-BNI的各组相比差异均无统计学意义(P＞0.05),结果表明kappa受体拮抗剂存在的情况下,大剂量喷他佐辛对吗啡镇痛依然存在抑制作用.结论:喷他佐辛可剂量依赖地抑制啡产生的镇痛作用,该抑制作用与kappa受体激动无关.
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慢性吗啡依赖大鼠条件性位置厌恶过程杏仁核中央核Kappa阿片受体表达变化
目的:探讨阿片依赖戒断后厌恶动机形成的生物学基础.方法:采用慢性吗啡腹腔注射注射一日两次(10 mg/kg)后予一次纳洛酮(0.3mg/kg)催瘾注射(同时与条件性位置训练箱搭配)建立大鼠条件性位置厌恶(CPA)模型.在CPA建立前后,采用免疫组织化学方法检测杏仁核中央核(CeA)内Kappa阿片受体(KOR)表达情况.结果:CPA建立前,吗啡注射+纳洛酮催瘾组(MN组)KOR蛋白表达水平(132.89±10.35)与吗啡对照组(MS组)(109.83±7.30)和纳洛酮组(SN组)(121.00±2.73),差异无统计学意义(P＞0.05).CPA建立后,三组KOR蛋白表达水平比较差异有统计学意义(P＜0.01)其中MN组(99.56±7.67)低于MS组(85.43±7.81,P＜0.01),高于SN组(118.25±1.71,P＜0.01).结论:①杏仁核中央核内Kappa受体的适应性变化,可能是慢性吗啡依赖大鼠纳洛酮催瘾戒断条件性位置厌恶模型建立的基础.②杏仁核中央核内Kappa受体的表达变化可能引起了慢性吗啡依赖大鼠纳洛酮催瘾戒断条件性位置厌恶模型发生突触可塑性的变化.
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人源KOR-GFP融合蛋白在昆虫细胞中的表达和活性鉴定
通过PCR方法扩增人源kappa型阿片受体基因(hKOR)和GFP基因,然后采用重叠延伸PCR(SOEPCR)将hKOR与GFP基因连接,并将融合基因通过无缝克隆技术克隆入pFastBac1载体,将筛选的阳性重组载体转化至含有杆状病毒穿梭载体和辅助载体的DH10αBac感受态细胞获得重组杆粒Bacmid-hKOR-GFP.采用重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,收获上清作为重组病毒P1代,采用流式细胞术检测病毒感染效率;采用Western blot 鉴定hKOR-GFP的表达情况;采用cAMP酶联免疫方法检测hKOR-GFP的功能活性.结果表明,采用感染复数(MOI)值为2,感染后72 h,hKOR-GFP在Sf9昆虫细胞中可达到高效表达;Western blot实验表明hKOR-GFP在昆虫细胞中获得正确表达;cAMP酶联免疫实验结果证明在激动剂存在下,Sf9细胞内cAMP含量出现剂量依赖性下降,表明hKOR-GFP具有生物活性.在昆虫细胞中高效表达具有功能活性的hKOR-GFP可为建立非成瘾性镇痛药物筛选技术平台奠定基础.
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共表达人kappa阿片受体与PKAcat-EGFP的CHO稳定细胞株建立及功能鉴定
目的 在中国仓鼠卵巢( Chinese hamster ovary, CHO)细胞上建立人kappa阿片受体( human kappa opioid receptor, hKOR)及增强型绿色荧光蛋白( enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基( catalytic domain of cAMP-dependent protein kinase A, PKAcat ) 融合蛋白(PKAcat-EGFP)稳定共表达的细胞模型,为体外高通量筛选作用于hKOR的药物及药物分子机制研究打下基础.方法通过脂质体介导法将潮霉素 B 抗性的 hKOR 重组质粒[pcDNA3.1/Hygro( +)-hKOR]转染入已稳定表达 PKAcat-EGFP的CHO细胞中,随后用含潮霉素B的选择性培养基培养细胞,有限稀释法挑取耐药单克隆,PKA重分布实验筛选阳性克隆,利用Z’因子对建立的细胞模型的可靠性进行评价,利用PKA重分布实验与LANCE cAMP 384 Kit检测受体功能.结果 PKA重分布实验与LANCE cAMP 384 Kit结果表明,CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13 号克隆反应性良好,100 nmol·L-1的U-50488作用时的Z’平均值为0.596,证明了该细胞模型的可靠性,且经多次传代后的受体表达也能保持稳定.结论 成功建立了hKOR与PKAcat-EGFP融合蛋白稳定共表达的细胞模型CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13.
