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氯化消毒对细菌抗生素抗性质粒及其所携抗性基因的转移及破坏机制研究
目的 研究氯化消毒在不同环境条件下对抗生素抗性细菌大肠埃希菌(E. coli)HB101 (pUC19质粒)的灭活规律以及对其抗生素抗性基因的转移和破坏机制.方法 将E. coli菌株与0.5、0.75、1.00、0.55 mg/L次氯酸钠作用后,分别在0.25、1、2、5、10、20、30 min的处理时间进行余氯测定、菌落计数,并采用消毒一级动力学模型和灭活动力学EFH模型进行拟合,获得E. coli的灭活曲线,同时,采用PCR技术进行抗生素抗性质粒pUC19质粒及其氨苄青霉素抗性基因(ampr)的检测,利用细菌转化试验评价抗生素抗性质粒的功能,计算达到不同的细胞杀灭对数值时的Ct值( t时刻的余氯浓度).结果 消毒温度和pH值对水中E. coli的杀灭、pUC19质粒和ampr的破坏具有显著影响,当消毒温度为4、20、36℃时,细胞消灭对数值达到5时所需Ct值分别为11.92、10.28、7.67 min·mg/L.同时,当消毒pH分别为6.0、7.2、8.0,氯浓度分别为0.75、0.70、0.55 mg/L时,细胞消灭对数值达到5时所需Ct值分别为6.68、10.28、15.73 min·mg/L.pH 7.2且消毒温度为4、20、36℃,氯浓度分别为9、5、3 mg/L时,为完全破坏细胞外游离抗生素抗性质粒的转化功能,消毒所需Ct值分别为36.11、34.17、16.09 min·mg/L.次氯酸钠消毒会导致游离ampr基因甚至具有转化功能的完整质粒pUC19质粒释放,并污染水体,只有当Ct值达到903.03 min·mg/L之后,完整的ampr基因才能被消除,远远超过细菌致死Ct值.结论 次氯酸钠消毒过程中,抗生素抗性细菌E. coli全部被破坏,但其携带抗生素抗性的DNA片段(质粒和基因)仍可能保持完整性且具有转化功能.
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利用基因组数据挖掘发现新抗生素的研究
随着多重耐药(MDR)细菌在全球范围内传播,细菌耐药性问题已成为影响人类健康的重大问题.虽然通过筛选细菌菌株获得抗生素的传统方法已经为研究者找到了目前可用的大多数抗生素,然而在过去的几十年中,这种方法产生的抗生素日益减少,且越来越难以发现具有新结构的化合物实体.目前,临床上甚至研发中能对抗超级耐药细菌的药物已寥寥无几,因此,开发和应用新的技术来应对细菌耐药性问题已经迫在眉睫.自20多年前对第一个细菌基因组进行测序以来,大量细菌基因组序列信息可以为新抗生素的发现提供线索.本文简要概述了现有的数据资源,并着重介绍了基因组挖掘和宏基因组挖掘在发现新抗生素中的应用.
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脱腐预处理对土壤总DNA提取质量的影响
目的 探索一种提高土壤总DNA提取质量的简易脱腐方法.方法 于2014年3月,采集河南省某市农田4个采样区的混合土样(07、08、1A、2A).分别用脱腐预处理后试剂盒提取(预处理组)和直接试剂盒提取法(未预处理组)提取土样总DNA,对保守序列16S rDNA和非保守序列(抗生素抗性基因sulⅡ、tetM、tetC和1类整合子酶基因intI1)进行PCR扩增.采用Gene Genius凝胶成像系统定量分析软件Gene Tools进行灰度值分析.结果 预处理组和未预处理组提取的各个土壤总DNA均可扩增出16S rDNA,且PCR产物灰度值差异无统计学意义(均P＞0.05);非保守序列sulⅡ、tetC和intI1基因的PCR扩增产物灰度值在两组中差异无统计学意义(均P＞0.05);预处理组tetM基因的表达水平高于未预处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).未预处理组的sul Ⅱ、tetM、tetC和intI1基因PCR扩增产物中均检测出了非特异性条带,而预处理组目的条带单一、较少非特异性条带.结论 脱腐预处理方法提取的土壤总DNA更有利于后续分子生物学实验.
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应用Tail-PCR分析sul1和tetW侧翼功能序列
目的 基于对抗生素抗性基因(sul1和tetW)侧翼序列分析,为研究其水平或垂直传递相关保守元件和机制提供方法 学基础和理论依据.方法 运用普通PCR对天津海河流域底泥中抗性基因进行定性分析,以多个样品的总DNA提取物为模板,运用Tail-PCR扩增分析sul1、tetW的侧翼序列.结果 磺胺类和四环素类抗性基因sul1和tetW普遍存在,并获得了sul1的左侧序列1 100bp,tetW右侧序列两条为608 bp、862 bp.结论 通过序列分析发现了多种保守结构域相关序列,以及全新的序列特征,结果 表明磺胺抗性基因与氨基糖苷类药物抗性基因存在连锁现象,四环素抗性基因与TnB1230存在连锁,并成功摸索了从混合模板中Tail-PCR获取特定位点多个侧翼序列的方法.
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农田土壤抗生素抗性基因与重金属分布状况
[目的]研究农田土壤抗生素抗性基因(ARGs)及重金属的分布状况. [方法]在河南省某地工业区附近农田(观察区)及对照地区共9个采样区(观察区7个,对照区2个),收集16个土壤混合样本(观察区14个,对照区2个),经腐殖酸脱除剂处理后试剂盒提取土壤总DNA.通过聚合酶链反应(PCR)检测土壤中5类15种ARGs(sulⅠ、sulⅡ、tetA、tetC、fetE、tetM、tetQ、tetW、CTX-M-1、bla-TEM、SHV、strA、qnrA、qnrB、qnrS).PCR检测阳性结果送公司测序,并通过GenBank数据库采用BLAST软件进行同源性比对.采用原子吸收分光光度法测定土壤中总汞含量;原子荧光光谱法测定土壤中总砷含量;电感耦合等离子体发射光谱法测定土壤中铅、锌含量;电感耦合等离子体质谱法测定土壤中镉、铬、镍、铜的含量. [结果]观察区土壤共检测出sulⅠ、sulⅡ、tetC、tetA、tet、bla-TEM、fetE、tetW、strA9种ARGs;除铬外,余7种重金属存在不同程度超标,其中镉和铅大超标倍数达72.7和6.5.对照区农田土壤中未检测到ARGs,且无一重金属含量超标.ARGs阳性土壤中镉含量超标率为100％;而ARGs阴性土壤中各种重金属均未超标.[结论]河南某地工业区附近农田土壤中抗生素抗性基因tetC、bla-TEM的分布广泛,同时主要存在重金属镉、铅污染.
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乌鲁木齐市医院医疗废水中细菌对抗生素的抗性水平
[目的]检测乌鲁木齐市医院医疗废水中细菌对抗生素的抗性水平. [方法]采集乌鲁木齐市4家综合性医院医疗废水处理系统进出水口样品,通过细菌平板培养法检测致病菌的抗生素抗性水平和医疗废水中总体抗生素抗性细菌的污染水平,通过PCR对致病菌株抗生素抗性的7种抗性基因(ampC,tetO,tetW,sull,sul2,qnrD和qnrS)进行检测. [结果]分离出的致病菌对氨苄西林、四环素、磺胺嘧啶和环丙沙星的耐药率分别为47.1％、63.4％、53.4％和42.4％,7种抗生素抗性基因在其对应的抗性致病菌的检出率为66.7％～100.0％.经污水处理系统处理后,仍有1.01×108～1.39×108 CFU/mL的抗生素抗性细菌进入自然环境. [结论]乌鲁木齐市医院医疗废水已受到抗生素抗性细菌的严重污染,成为抗生素抗性细菌的储存库和污染来源之一.
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浙江省钱塘江流域抗生素抗性基因监测分析
目的 研究钱塘江流域抗生素抗性基因分布情况.方法 本研究以钱塘江流域上游、中游、下游共18份水样为研究对象, 监测四环素、磺胺二甲嘧啶、氨苄青霉素的耐药菌分布, 用PCR检测代表抗性基因tet A、sul I和ctx-1, 用荧光定量PCR检测其Ct值和相对表达量, 分析钱塘江流域耐药菌变化趋势.结果 18份水样中氨苄青霉素、磺胺二甲嘧啶、四环素的耐药菌生长阳性率分别为100.00％、88.89％和61.11％;PCR检测各水样混合微生物DNA中tet A、sul I和ctx-1, 目的条带阳性率分别为70.59％、47.06％和52.94％;荧光定量PCR结果显示自上游到中游, 对三类抗生素耐药性均呈上升趋势, 居民区河水耐药菌表达量平均多于钱塘江水, 而sul I相对表达量高.结论 钱塘江流域存在tet A、sul I和ctx-1等ARGs的污染, 变化趋势与人为活动的富集污染程度、地理环境有关.
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河南某工厂附近农田土壤中抗生素抗性基因与可移动遗传元件的分布
目的:观察河南某工厂附近农田土壤中抗生素抗性基因和可移动遗传元件的分布.方法:分别于不同时间点采集河南某工厂主导风向下风向上距离为700～2 500 m不等的7块农田土壤的土样,提取总DNA,采用PCR法检测15种抗生素抗性基因(包括四环素类药物抗性基因tetA、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW,磺胺类药物抗性基因sul Ⅰ、sulⅡ,β内酰胺类药物抗性基因bla-TEM、SHV、CTX-M-1,喹诺酮类药物的抗性基因qnrA、qnrB、qnrS,链霉素类药物抗性基因strA)和4种可移动遗传元件(包括整合酶基因intI1、intI2,插入序列共同区基因orf513、ISCR2),PCR阳性产物送测序,通过BLAST与GenBank数据库进行同源性比对.结果:共检出8种抗生素抗性基因,分别是sulⅡ、tetC、bla-TEM、sul Ⅰ 、tetA、strA、tetM和tetW;3种可移动遗传元件intI1、intI2、ISCR2.各PCR扩增阳性产物经测序比对后,与GenBank已有序列识别度为95％～ 100％.各基因在不同距离土样中的阳性率比较差异均无统计学意义(P＞0.05),sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1在不同时间点的土样中阳性率比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:该工厂附近农田土壤中常见抗生素抗性基因及可移动基因元件为sulⅡ、tetC、bla-TEM、sul Ⅰ和intI1,除sul Ⅰ外,sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1的分布均具有时间差异,但在不同距离农田土壤中分布稳定.
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多种抗生素抗性基因在儿童肠道菌群的携带状况
目的 了解儿童肠道菌群中多种抗生素抗性基因的携带情况.方法 采集3～5岁儿童粪便标本,分别为3月内未使用抗生素标本8例和1～3周内使用过头孢类抗生素标本8例.提取粪便细菌总DNA,PCR分析抗生素抗性基因.结果 在两组各7例样本中检出四环素抗性基因tetB,两组全部样本中均检出大环内酯类抗生素抗性基因ermB,1～3周内使用过头孢类抗生素儿童中β-内酰胺类抗生素抗性基因blaTEM检出数高于对照组.结论 儿童肠道菌群中普遍存在四环素抗性基因tetB和大环内酯类抗生素抗性基因ermB,短期使用头孢类抗生素儿童粪便中携带β-内酰胺酶类抗生素抗性基因blaTEM数较3月内未使用抗生素儿童数多.
