首页 > 文献资料
-
实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建
[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23sITS重组质粒,为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准.[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s一23sITS特异基因作为目的靶序列,设计、合成引物和探针,采用普通PCR扩增特异靶序列,克隆到pGM-T载体后,转化感受态大肠埃希菌DH5α,经蓝白斑筛选,再分别用EcoRI酶切,普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组.建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线.[结果]成功构建目的重组质粒,并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线.重组质粒标准具有较大的线性范围(102copies/μl～108%opies/μl)和灵敏度.[结论]该方法构建的16s-23sITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求,为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件.
关键词： 杆菌 蜡样芽胞 TaqManTM探针 重组质粒 实时荧光定量PCR -
TaqManTM实时荧光PCR快速检测副溶血性弧菌的初步研究
目的:建立TaqManTM实时荧光pcr检测副溶血性弧菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中副溶血性弧菌染菌率的调查提供手段.方法:通过分析,终选择tlh基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条TLH基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用核酸提取试剂盒煮沸法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立副溶血性弧菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法.结果:选取的tlh基因同源性达到98.9%以上(13/1234),同源性好.通过对各实验条件的优化,得到副溶血性弧菌TaqManTM实时荧光PCR的佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速检验方法.结论:TaqManTM实时荧光PCR检测灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高副溶血性弧菌的检出率和检测准确性.
关键词： 副溶血性弧菌 TaqManTM探针 实时荧光PCR 快速检测 -
肾综合征出血热多重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立
目的 探讨肾综合征出血热多重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测的方法.方法 将96份肾综合征出血热(HFRS)患者血清作为检测对象,根据汉坦病毒(HV)株序列自行设计引物和Taq-ManTM探针,通过制备基因组DNA对引物浓度、探针浓度等条件进行优化,初步形成HV病毒的多重Taq-Man-MGB荧光定量RT-PCR快速检测方法.结果 通过优化实验室条件后筛选出多重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的理想反应条件,初步建立了快速检测HV病毒的方法,检测过程过程历时1.5h.结论 多重TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR具有高敏感性、高特异性的特点,检测耗时短,提高了汉坦病毒的检出率,有助于临床的早期诊断.
关键词： 肾综合征出血热 汉坦病毒 聚合酶链反应 TaqManTM探针 -
TaqManTM实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的初步研究
目的:建立实时荧光TaqManTM定量检测蜡样芽胞杆菌的快速检测方法,为食品中蜡样芽胞杆菌污染的调查及食物中毒的快速准确定量检测提供手段.方法:通过分析蜡样芽胞杆菌16S rDNA、23S rDNA、16S-23S ITS、gyrB、groEL、cereolysin AB、HBL(hblA、hblC、hblD)、NHE(nheA、nheC、nheD)、bce-T等目的基因,对比所选取的不同目的基因优缺点,终选择合适的目的基因16S-23S ITS进行同源性分析,并根据GenBank公布的蜡样芽胞杆菌16S-23S ITS基因的保守序列,用引物与探针专业设计软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型TM基因组DNA提取法制备DNA标准品,通过对TaqManTM实时荧光PCR退火温度、探针浓度、引物浓度、Mg2+离子浓度、缓冲液浓度及酶用量等反应条件的优化,初步建立蜡样芽胞杆菌的实时荧光TaqManTM快速定量检测方法,并利用该方法对模拟样品进行检测.结果:选取的16S-23S ITS基因同源性达到99%以上,特异性好;所有蜡样芽胞杆菌均含有两段16S-23SITS基因,有利于提高反应的灵敏度.通过对各实验条件的优化,得出蜡样芽胞杆菌TaqManTM实时荧光PCR的佳反应条件,初步建立起实时荧光TaqManTM定量检测蜡样芽胞杆菌的快速检测方法,该方法能在3 h左右完成整个检测过程.结论:实时荧光TaqManTM定量检测法不但灵敏度好,而且特异性高,检测时间短,能提高蜡样芽胞杆菌的检出率和检测准确性,可望应用于蜡样芽胞杆菌食物中毒的快速准确定量诊断.
关键词： 蜡样芽胞杆菌 TaqManTM探针 实时荧光PCR 快速检测 -
TaqManTM实时荧光PCR快速检测沙门氏菌的初步研究
[目的]建立实时荧光TaqManTM检测沙门氏菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中沙门氏菌染菌的调查提供手段,也为建立实时荧光TaqManTM同时检测多种细菌性食物中毒目标菌奠定基础. [方法]通过分析沙门氏菌invA、hilA、fimA、hns、spy、hut基因和16S rDNA等目的基因,对比不同目的基因的优缺点,终选择hut基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条hut基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型基因组DNA提取法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立沙门氏菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法. [结果]选取的hut基因同源性达到99％以上,特异性好.通过对各实验条件的优化,得到沙门氏菌TaqManTM实时荧光PCR的佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测沙门氏菌的快速检验方法,该方法能在1h内完成整个检测过程.[结论]TaqManTM实时荧光PCR检测不但灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高沙门氏菌的检出率和检测准确性,可望应用于沙门氏菌食品及食物中毒的快速定性检测.
关键词： 沙门氏菌 TaqManTM探针 实时荧光PCR 快速检测
