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结核分枝杆菌复苏因子对结核性胸腔积液中结核分枝杆菌生长促进作用的探索
目的 探讨结核分枝杆菌复苏因子(resuscitation promoting factor,Rpf)对结核性胸腔积液中病原菌生长的促进作用,以期提高临床标本体外培养阳性率,缩短培养时间.方法 选择2012年10月至2013年10月期间北京胸科医院62例结核性胸膜炎患者,抽取胸腔积液经过离心处理后分别接种于改良罗氏培养基,以及含高、低浓度Rpf的MiddleBrook 7H11固体培养基(简称“7H11培养基”)和生理盐水7H11培养基(生理盐水阴性对照组)中,每隔3d观察菌落形成情况,阳性者行抗酸染色(AFB)、PCR扩增试验及DNA测序进行菌种鉴定,观察比较高、低浓度Rpf对Mtb的促进生长作用.利用统计软件SPSS 17.0进行统计学分析.Rpf培养组与改良罗氏培养组,以及Rpf培养组与生理盐水阴性对照组Mtb培养阳性率比较采用配对计数资料的x2检验;不同浓度Rpf培养组与生理盐水阴性对照组可视菌落平均时间(d)和阳性菌落数量比较采用配对样本t检验.以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 (1)结核性胸腔积液改良罗氏培养组中的Mtb培养阳性率为16.1％(10/62),含Rpf的7H11培养基中的Mtb培养阳性率为43.5％(27/62),两者比较差异具有统计学意义(x2=12.84,P＜0.01);(2)含高、低浓度Rpf 7H11培养基的可视菌落形成时间各为(20.92±0.58)d和(21.69±0.50)d,两组间差异无统计学意义(t=0.085,P＞0.05),但显著快于生理盐水对照组(不含Rpf)的(38.08±0.94)d(t值分别为10.19、9.91,P值均＜0.001);(3)含高、低浓度Rpf的7H11培养基菌落形成单位数各为(34.12±4.06)×102和(37.27±5.63)×102,两组间差异无统计学意义(t=0.45,P＞0.05),但显著多于生理盐水对照组(3.77±0.88)×102(t值分别为5.88、7.30,P值均＜0.001).结论 接种结核性胸腔积液后,含Rpf的7H11培养基较改良罗氏培养基可提高Mtb的培养阳性率,并缩短培养时间.
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结核分枝杆菌的复苏因子
1998年Mukamolova等[1]在细菌因子一文中首先提出了复苏因子(resuscitation promoting factor,Rpf)的新概念,并证实复苏因子是由有活性的微球菌分泌的一种蛋白质,它在皮摩尔级浓度就能有效地促进休眠的非生长同源菌的复苏和生长.
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脑脊液标本结核分枝杆菌的快速培养
目的 建立结核性脑炎脑脊液中结核分枝杆菌快速培养的方法.方法 在7H9液体培养基加入一定浓度的复苏因子蛋白,接种脑脊液后进行培养,并用不含复苏因子蛋白质的7H9培养做对照.分别在第0、6、11、16和30 d检测培养物的吸光度(A)值;取培养物10μl涂7H11平板,培养后进行CFU计数、抗酸染色.同时将标本进行罗氏培养和涂片抗酸染色.结果 结核分枝杆菌复苏培养阳性率、涂片阳性率分别为55.00%和30.00,差异有统计学意义(P<0.05);复苏培养阳性率与罗氏培养阳性率35.00%比较,差异无统计学意义(P>0.05).复苏培养的结核杆菌平均在第10d进入对数生长期,其A值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 结核杆菌复苏因子能促进脑脊液中结核杆菌的生长.
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复苏因子促进休眠结核杆菌复苏作用的研究
目的 研究复苏因子蛋白对休眠结核杆茵的复苏作用,探索对休眠结核杆菌的佳复苏方案.方法 应用含不同浓度复苏因子蛋白的7H9液体培养基培养休眠结核杆菌H37Rv.分别在第6天、第11天、第16天、第30天检测培养物的OD值、并取10uL培养液涂于7H11平板培养、抗酸染色.结果 低浓度组合有佳复苏效果,高浓度复苏因子组合抑制休眠结核菌复苏.低浓度复苏因子A和高、低浓度的复苏因子B、C、E均有不同程度的复苏促进作用,复苏因子D和高浓度的复苏因子A均无复苏作用.重复试验结果相同.结论 结核杆菌复苏因子蛋白对结核杆菌有复苏促进作用.
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脊柱结核脓液中结核杆菌的复苏培养
目的:探讨结核杆菌复苏因子(rpf)对脊柱结核脓液中结核杆菌生长的影响.方法:由宁夏医学院第一附属医院骨科提供的临床诊断为脊柱结核的住院患者手术获取的脓液标本25份,氢氧化钠溶液常规处理后,每份标本分为低浓度培养组、高浓度培养组和对照组.高浓度和低浓度组各设6管,分别含高、低两种浓度的rpf A、B、C、D、E及各种复苏因子组合,每管中加入7ml 7H9液体培养基,并加入处理后的标本和相应的rpf;对照组1管,不加rpf.37℃培养,分别在第6天、第11天、第16天、第30天检测培养物600nm处的吸光度(OD值),同时于上述各时间点每管取10μl培养物涂7H11平板培养,取第30天培养物行抗酸染色检查,以证实培养物为结核杆菌.同时将处理后的脓液标本进行集菌法涂片抗酸染色和改良罗氏培养检测结核杆菌.结果:结核杆菌复苏培养阳性率(84%)显著高于涂片阳性率(60%)和改良罗氏培养阳性率(44%)(P＜0.05或0.01).复苏培养低浓度各组与高浓度各组在培养第11天、第16天和第30天时培养物OD值均显著高于对照组(P＜0.05);复苏培养同一组内第11天、第16天和第30天时培养物OD值均显著高于第6天(P＜0.01),而第16天和第30天与第11天比较无显著性差异(P＞0.05);对照组第11天、第16天和第30天培养物OD值与第6天比较均无显著性差异(P＞0.05);同一时间、同一浓度时,5种复苏因子单独应用与联合应用之间两两比较,除高浓度rpf A、B在培养第30天时分别与同一浓度、同一时间的rpf C、D、E和组合组之间及rpf A与B之间比较有显著性差异(P＜0.05)外,其余均无显著性差异;同一种复苏培养,在同一时间高、低浓度比较,第30天时高浓度rpf A、B的OD值高于低浓度rpf A、B(P＜0.05),低浓度rpf D高于高浓度rpf D(P＜0.05),其余均无显著性差异.11例改良罗氏培养阳性和21例复苏培养阳性者的培养生长物抗酸染色检查均为抗酸杆菌,复苏培养生长物7H11平板培养第20d时可见淡黄色菜花状菌落,证实为结核杆菌.结论:结核杆菌复苏因子能有效促进脊柱结核脓液中结核杆菌的迅速生长,复苏培养法能提高脊柱结核脓液中结核杆菌的检出率.
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结核分枝杆菌休眠菌的复苏培养与初始菌量的关系
目的 探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系.方法 取培养100 d的陈旧结核分枝杆菌(休眠菌),用7H9稀释成麦氏比浊1 mg/ml,之后倍比稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/ml.取12支无菌培养管,加入5 ml 7H9培养基并分为2组,每组依次加入上述各浓度结核分枝杆菌,第1组加入复苏因子蛋白质,第2组作为对照加入等体积7H9,37℃培养,分别在15、25、30、35 d检测光密度值,并取1μl培养液涂7H11平板培养,进行菌落计数.重复上述实验.结果 0、15、25、30、35 d分光光度计检测光密度(OD)值结果显示:各浓度组间细菌增殖呈直线正相关性(P<0.05,P<0.01),即复苏因子对不同稀释浓度的复苏作用相同.7H11培养结果和OD值检测结果显示:各组两种方法检测结果呈直线相关性(P<0.05,P<0.01),即两种方法检测结果有一致性.结论 复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用与初始菌量无关.
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复苏因子促进休眠结核杆菌复苏作用的研究
目的 研究复苏因子蛋白对休眠结核杆菌的复苏作用,探索对休眠结核杆菌的佳复苏方案.方法 应用含不同浓度复苏因子蛋白的7H9液体培养基培养休眠结核杆菌H37Rv,分别在第6天、第11天、第16天和第30夭检测培养物的OD值、并取10 μL培养液涂于7H1 1平板培养、抗酸染色.结果 低浓度组合有佳复苏效果.高浓度复苏因子组合抑制休眠结核菌复苏.低浓度复苏因子A和高、低浓度的复苏因子B、C、E均有不同程度的复苏促进作用,复苏因子D和高浓度的复苏因子A均无复苏作用.重复试验结果 相同.结论 结核杆菌复苏因子蛋白对结核杆菌有复苏促进作用.
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结核分枝杆菌复苏因子D的克隆及测序分析
目的 克隆结核分枝杆菌Rv2389c基因.方法 常规方法提取结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA,PCR扩增结核分枝杆菌Rv2389c基因,经内切酶酶切、胶回收,将片段亚克隆到T载体中,转化至DH5α.以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养,菌液进行质粒提取、酶切、胶回收,回收片段再克隆至表达载体pET30a中,转化至DH5α中.PCR阳性菌落转至LB中培养,测序确定插入片段的正确性.结果 构建了Rv2389c重组表达质粒PET30a-Rv2389c.结论 成功克隆了结核分枝杆菌复苏因子Rv2389c基因.
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结核杆菌复苏促进因子在分枝杆菌培养中的作用观察
目的 探讨结核杆菌复苏因子(TB-RPF)在结核患者标本的分枝杆菌培养中的作用.方法 收集疑似结核患者的痰液42例,支冲液8例,胸腔积液25例,经4%NaOH液化处理后用PBS洗涤并悬浮菌体,每份标本分设对照组和RPF组,按照两组各0.5 ml菌液量接种于MGIT培养管.对照组培养基采用含Middlebrook7H9的常规MGIT培养管,RPF组则在对照组基础上加入Rpf A/B/C/D/E五种蛋白混合物.接种后的所有培养管放入960全自动分枝杆菌培养系统中培养.阳性培养物行分枝杆菌菌种鉴定,记录培阳标本的报阳时间,统计培阳率.结果 痰液的RPF组和对照组培阳率分别为42.86%(18/42)和45.24%(19/42);支冲液的RPF组和对照组的培阳率分别为37.5%(3/8)和62.5%(5/8);胸腔积液的RPF组和对照组的培阳率均为20%(5/25),各类标本两组间培阳率差异无统计学意义(P＞0.05).在结核培阳的标本中,9例为两组报阳天数相等;6例(胸水3例,痰2例,支冲液1例)RPF组报阳天数少于对照组,缩短天数为1～11天,平均缩短4.33天;9例RPF组报阳天数长于对照组,延长时间为1～2天,平均延长1.11天.另有3例对照组结核培阳,而RPF组培阴.结论 结核杆菌复苏因子对痰液、支冲液和胸水的结核培阳率无明显提高,对胸水结核培阳时间的缩短有较明显的促进作用.复苏因子在不同标本中的复苏作用有待进一步摸索.
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结核杆菌复苏因子在骨/关节穿刺抽取物分枝杆菌培养中的作用观察
目的 探讨结核杆菌复苏因子RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE混合物对骨/关节穿刺抽取物分枝杆菌培养是否具有促进作用.方法 对32例胸椎、腰椎、肘、肩、髋、膝、踝等骨/关节穿刺抽取物进行了分枝杆菌培养,按BACTEC 960全自动分枝杆菌培养系统操作指南对骨/关节穿刺抽取物进行样本前处理;分别吸取约0.2 ml前处理样本沉淀混悬液加入两支BACTEC 960全自动分枝杆菌培养系统专用培养管(BBLTMMGITTM7 ml),并在实验管中加入0.1 ml浓度分别为64 ng/ml、53.3 ng/ml、84.6 ng/ml、23.5 ng/ml和20.9 ng/ml的结核杆菌复苏因子RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE混合物,不加复苏因子者为对照管;然后将实验管和对照管一同放入BACTEC 960培养仪中监测,阳性者抗酸染色确认,培养42 d不显示阳性者判为培养阴性.后比较实验管和对照管的阳性例数和阳性结果报告时间.结果 实验组培养阳性9例,对照组培养阳性8例,共同阳性8例;在8例共同阳性样本中,实验组有3例阳性报告时间比对照组提前近1周,其他5例阳性报告时间相同,实验组阳性报告平均时间为17.3 d,对照组阳性报告平均时间为19.4 d.结论 从总体水平看,结核杆菌复苏因子RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE混合物对骨/关节穿刺提取物分枝杆菌培养具有较为明显的促进作用.
