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发光二极管照射对高糖培养的视网膜神经元凋亡的光生物调节作用及其机制
背景 研究糖尿病视网膜病变(DR)的发病机制及防治具有重要的临床意义.近年来随着生物医学光子学研究的发展,国际上利用光生物调节进行疾病防治的研究越来越受到重视,但关于光生物调节对DR的防治作用研究鲜见报道. 目的 探讨光生物调节对高糖环境下视网膜神经元凋亡的抑制作用及其机制,为光生物调节在DR治疗方面的应用提供依据.方法 采用免疫磁珠分离法分离Wistar大鼠视网膜神经元并进行传代培养,采用Nissl染色法对培养的细胞进行鉴定.将培养的细胞分为正常对照组、高糖模型组和高糖+发光二极管(LED)组,正常对照组细胞采用Neurobasal培养基进行培养,高糖模型组细胞在Neurobasal培养基中添加25 mmol/L葡萄糖,高糖+LED组细胞造模后48 h在培养箱中用LED红光光源进行照射,光源波长为620 nm,大功率为1W,中心光辐射照度为6.67 mW/cm2.光源置于细胞上方2 cm处,光斑直径为2.0cm,使光斑完全覆盖1个培养孔,每次连续照射300 s,12h后重复照射1次,共照射3次.培养后48 h采用流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况;采用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞内Ca2+浓度变化;Western blot法检测各组细胞中磷酸化丝氨酸-苏氨酸激酶(p-AKT)蛋白的相对表达量.结果 培养后2～3d,倒置显微镜下可见细胞呈多边形和椭圆形,可见细胞核及核仁.培养后5～7d神经元突起增多,经Nissl染色后细胞质呈蓝紫色,神经元与神经胶质细胞的比例达91％.正常对照组、高糖模型组和高糖+LED组细胞凋亡率分别为(7.634_±3.176)％、(33.642±9.315)％和(23.914±6.375)％,其中高糖模型组和高糖+LED组细胞凋亡率均明显高于正常对照组,高糖+ LED组细胞凋亡率明显低于高糖模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.0l).激光扫描共焦显微镜下可见高糖模型组和高糖+LED组细胞中Ca2+荧光像素值均明显高于正常对照组,高糖+LED组细胞中Ca2+荧光像素值明显低于高糖模型组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).Westen blot法检测显示正常对照组、高糖模型组和高糖+LED组细胞中p-AKT蛋白相对表达量分别为10.34±3.18、2.16±0.46和7.15±1.72,高糖+LED组细胞中p-AKT蛋白相对表达量明显低于高糖模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 高糖环境抑制抗凋亡的PI3K/AKT通路活性并影响视网膜神经元钙稳态,导致细胞凋亡.低强度LED光照射可激活PI3K/AKT通路,减少高糖引起的细胞凋亡.
