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腺病毒介导的重组Tum5基因对生理状态下脐静脉血管内皮细胞生物学行为的抑制作用
背景 肿瘤抑素是迄今发现活性强的内源性血管生成抑制因子,对病理性新生血管形成有明显抑制作用.Tum5片段为肿瘤抑素的抗血管生成活性片断. 目的 研究腺病毒介导的Tum5重组基因过表达对生理状态下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、迁移及管腔形成的影响. 方法 构建表达绿色荧光蛋白的空载体腺病毒(rAd-GFP)和携带重组Tum5基因的腺病毒载体(rAd-Tum5).将HUVECs分为正常对照组、空载体组(rAd-GFP组)和Tum5基因组(rAd-GFP-Tum5组).将rAd-GFP和rAd-Tum5病毒颗粒(1×101o/ml)各20μl分别加入rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组培养液以感染培养的细胞48 h,倒置荧光显微镜下观察各组细胞中GFP的表达,并计算病毒的感染效率;采用细胞计数试剂盒(CCK)-8检测各组细胞在波长为450 nm处的吸光度(A)值并计算细胞增生率;采用Transwell小室实验测定各组的迁移细胞数目;采用基质胶(Matrigel)实验检测各组细胞的管腔形成数;采用人血管内皮生长因子(VEGF) ELISA试剂盒检测细胞感染后24、48和72 h各组细胞培养上清液中VEGF质量浓度. 结果 倒置荧光显微镜下可见rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组HUVECs中呈绿色荧光,rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组的感染效率分别为55.13％和50.31％.细胞感染后24 h和48 h,正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组细胞增生率比较差异均无统计学意义(均P＞0.05);细胞感染后72 h,rAd-GFP-Tum5组细胞增生率明显低于正常对照组和rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞感染后48 h,正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组迁移细胞数分别为(2 260.25±930.44)、(2 370.00±441.06)和(723.75±363.80)个,总体比较差异有统计学意义(F=8.524,P=0.008),rAd-GFP-Tum5组迁移细胞数量较正常对照组和rAd-GFP组均明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.01).正常对照组、rAd-GFP组和rAd-GFP-Tum5组平均每张图片中管腔形成数目分别为(95.67±5.86)、(88.00±4.58)和(20.67±3.51)个,总体比较差异有统计学意义(F=226.498,P＜0.01),其中rAd-GFP-Tum5组细胞管腔形成数量较正常对照组和rAd-GFP组明显减少,差异均有统计学意义(均P＜0.01).细胞感染后24、48和72 h,各组细胞培养上清液中VEGF蛋白质量浓度总体比较差异均有统计学意义(F分组=73.260,P＜0.01;F时间码 =73.477,P＜0.01);其中感染后48 h和72 h,rAd-GFP-Tum5组VEGF质量浓度均明显低于rAd-GFP组,差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 腺病毒介导的重组Tum5基因的过表达可抑制生理状态下HUVECs的增生、迁移及管腔形成,这可能与Tum5下调VEGF在细胞上清液中的含量有关.
