首页 > 文献资料
-
SiRNA抑制高氧暴露下A549细胞硫氧还蛋白-2表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系
目的 研究小分子干扰RNA (SiRNA)抑制高氧暴露下人肺腺癌A549细胞硫氧还蛋白-2(Trx-2)表达及其与肺细胞代谢和凋亡的关系,探讨高氧肺损伤的发病机制和防治措施.方法 体外传代培养A549细胞系,待其生长至接近亚汇合状态时,将体外化学合成Trx-2序列特异性的SiRNA通过Lipofectamine2000转染A549细胞.将细胞随机分为无干扰空气组、无干扰高氧组、干扰后空气组、干扰后高氧组4组.高氧组持续暴露于常压高浓度氧(92％O2,5％CO2)中；空气组仍置于5％CO2培养箱中.4组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h提取A549细胞总RNA.采用半定量RT-PCR测定Trx-2、三磷酸腺苷合成酶6,8(ATPase 6、8)及细胞色素C (CytC)mRNA的表达；Western-blot检测Trx-2蛋白表达；流式细胞术检测高氧和沉默Trx-2对A549细胞凋亡的影响.结果 序列特异性SiRNA可抑制Trx-2表达,SiRNA-1、SiRNA-2、SiRNA-3 3组Trx-2蛋白表达均受到抑制,SiRNA-1组抑制效率高(79.51％).与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12 h CytC和24 h Trx-2 mRNA的表达增高,48 h CytC mRNA的表达降低(P＜0.05).与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h Trx-2 mRNA的表达减弱,但在12、24 h CytC mRNA表达水平升高(P＜0.05).与无干扰空气组相比,无干扰高氧组12、48 hATPase 6 mRNA的表达增高,24、48 h ATPase 8 mRNA的表达增高(P＜0.05).与干扰后空气组相比,干扰后高氧组24、48 h ATPase 6,8 mRNA的表达减弱(P＜0.05).干扰后高氧组24、48 h A549细胞凋亡百分数明显高于干扰后空气组(P＜0.05).结论 高氧暴露和沉默Trx-2导致A549细胞ATPase 6,8表达下调和CytC表达升高,表明能量代谢障碍和细胞凋亡参与高氧肺损伤发病过程,Trx-2对高氧肺损伤线粒体起重要的保护作用.
-
硫氧还蛋白-2和细胞色素C在高氧暴露下A549细胞中的表达和意义
目的 观察高体积分数氧(高氧)暴露后人肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的肺腺癌A549细胞中硫氧还蛋白-2(Trx-2)和细胞色素c(Cytc)的动态表达,探讨Trx-2和Cytc表达变化在高氧肺损伤中的作用.方法 复苏液氮罐中冻存的人肺腺癌A549细胞系后,加入100 g/L胎牛血清的MEM培养基,置于37℃50 mL/L二氧化碳(CO2)饱和湿度培养箱中培养.然后体外传代培养A549细胞,待其生长至接近融合状态时,随机分为高氧组和空气组,每组18瓶A549细胞(50 mL培养瓶).高氧组持续暴露于常压高氧中,氧体积分数为900 mL/L,CO2体积分数为50 mL/L;空气组仍置于50 mL/L CO2培养箱中.二组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h后提取A549细胞总RNA,半定量反转录聚合酶链反应检测Trx-2和CytcmRNA水平;蛋白印迹法检测A549细胞Trx-2蛋白的表达变化.结果 1.与空气组比较,高氧组24 h Trx-2 mRNA的表达显著增强(P＜0.05);48 h Trx-2 mRNA的表达减弱,二组比较无显著性差异(P＞0.05).2.与空气组比较,高氧组12 h Cytc mRNA的表达显著增强(P＜0.05);24 h Cytc mRNA的表达减弱,二组比较无显著性差异(P＞0.05);48 h显著减弱(P＜0.05).3.与空气组比较,高氧组12 h Trx-2蛋白的表达显著增强(P＜0.05);24 h仍增强,二组比较无显著差异(P＞0.05);48 h显著减弱(P＜0.05).结论 高氧暴露可诱导A549细胞中Trx-2和Cytc异常表达,提示Trx-2对高氧肺损伤线粒体可能起重要的保护作用,Cytc在高氧肺损伤细胞凋亡发生发展中起重要作用.
-
硫氧还蛋白-2在急性白血病患者骨髓中的表达及意义
目的 探讨TRX-2基因表达水平与急性白血病及临床特征的关系.方法 应用适时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)和间接免疫荧光试验检测试验组120例急性白血病和对照组120例非血液病的其他疾病患者骨髓TRX-2基因表达情况,并结合临床资料进行分析.结果 经RT-PCR检测,试验组TRX-2 mRNA骨髓表达量明显高于对照组,两组差异具有统计学意义[(5.08±0.52)×102 vs.(0.91±0.15)×102,P＜0.05].其中试验组中原始细胞≥90％的样本TRX-2表达量比原始细胞＜90％患者明显增多,其差异具有统计学意义[(6.79±0.51)×102 vs.(3.26±0.58)×102,P＜0.05].而骨髓中TRX-2的表达量与年龄、性别和急性白血病的类型无相关性；间接免疫荧光试验检测试验组骨髓原始细胞不同程度表达TRX-2,阳性表达率78.2％,而对照组无阳性表达；TRX-2的RT-PCR检测与间接免疫荧光法检测两种方法之间具有显著相关性(P＜0.05),但一致性较差(κ=0.26).结论 TRX-2在急性白血病骨髓中呈现高表达,其与急性白血病原始细胞的负荷量存在相关性,而与临床特征无明显相关；RT-PCR与间接免疫荧光法两种方法检测TRX-2之间具有显著相关性,但一致性较差.
关键词： 硫氧还蛋白-2 急性白血病 适时定量聚合酶链反应 间接免疫荧光试验 -
高氧对人肺腺癌A549细胞中硫氧还蛋白-2表达的影响
目的 研究高浓度氧暴露对人肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的肺腺癌A549细胞中硫氧还蛋白-2 (thioredoxin-2,Trx-2)表达的影响,探讨Trx-2 对高氧肺损伤线粒体的保护作用.方法 体外传代培养 A549细胞系,待其在37 ℃、5% CO2培养箱中生长至接近融合状态时,随机分为高氧组和空气组.高氧组持续暴露于常压高浓度氧中,氧浓度 > 90%,CO2浓度为 5%;空气组仍置于含5% CO2培养箱中.两组分别于高氧或空气暴露12、24、48 h 提取A549 细胞总RNA,采取半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定Trx-2 mRNA的表达;采用 Western blot 检测A549 细胞Trx-2 蛋白的表达变化.结果 ①与空气组相比,A549 细胞高氧暴露24 h Trx-2 mRNA 表达显著增强(P<0.05);48 h 后Trx-2 mRNA呈下降趋势,其表达较空气组减弱,但两者差异无显著性意义(P>0.05).②与空气组相比,A549 细胞高氧暴露后 12 h Trx-2 蛋白表达水平显著增强(P<0.05),随后逐渐减弱,至48 h 显著减弱(P<0.05).结论 高浓度氧暴露诱导A549 细胞中Trx-2 动态表达的变化,这种变化表明Trx-2 对高氧肺损伤线粒体可能起重要的保护作用.
-
硫氧还蛋白-2在氧化损伤的人晶状体上皮细胞中的表达及其意义
目的:探讨硫氧还蛋白-2(thioredoin-2,Trx-2)是否参与白内障的发病过程及其对过氧化氢(H2O2)诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响.方法:选取志愿者(因外伤行透明晶状体取出术患者)10例和行超声乳化白内障手术患者(年龄大于60岁)30例的晶状体前囊膜,采用链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法检测志愿者和白内障患者晶状体上皮细胞中Trx-2蛋白的表达情况.体外培养SRA01/04细胞,根据不同处理分为空白对照组、20μmol/L H2O2组、50 μmol/L H2O2组、100 μmol/L H2O2组、阴性对照组(转染对照空pCMV6质粒并用100μmol/LH2O2处理)和过表达Trx-2组(转染pCMV6-Trx-2过表达质粒并用100μmol/L H2O2处理).采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测各组细胞活力;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡;采用化学比色法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,谷胱甘肽(glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;采用Western印迹检测各组细胞中Trx-2以及B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma 2 protein,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的表达.结果:与志愿者相比,白内障患者晶状体上皮细胞中Trx-2蛋白表达明显减少(P＜0.05).与空白对照组比较,20,50,100μmol/L H202组Trx-2蛋白表达量均明显降低(均P＜0.05).与空白对照组相比,100μmol/LH2O2组和阴性对照组细胞存活率降低、凋亡率增加,细胞内SOD和CAT活性降低、GSH含量减少、MDA含量增加,Trx-2和Bcl-2蛋白表达降低,Bax和caspase-3蛋白表达增加(均P＜0.05).与阴性对照组比较,过表达Trx-2组细胞存活率增加、凋亡率降低,SOD和CAT活性增加、GSH含量升高、MDA含量降低,Trx-2和Bcl-2蛋白表达增加,Bax和caspase-3蛋白表达减少(均P＜0.05).结论:Trx-2参与白内障发病中上皮细胞的凋亡,过表达Trx-2能够减少H2O2诱导的细胞凋亡,这可能与拮抗H2O2诱导的氧化损伤有关.
-
大鼠自体原位肝移植24h后肝内硫氧还蛋白-2的表达和抗氧化能力的变化
[目的]探讨线粒体硫氧还蛋白(Trx2)和抗氧化能力在原位自体原位肝移植(AOLT)大鼠后24 h内肝脏组织动态变化.[方法]将40只雄性SD大鼠随机均分为假手术组(Group S,n=8)、肝移植后4h组(LTR 4h group,n=8),肝移植后8h组(LTR 8h group,n=8),肝移植后16h组(LTR 16h group,n=8)和肝移植后24 h组(LTR 24h group,n=8).S组只进行开腹和血管的分离,各肝移植组接受自体原位肝移植(AOLT),光镜下观察各组大鼠肝脏病理学改变,Suzuki病理学评分改变,实验室检测活性氧水平、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)活性、总抗氧化能力(TOC)变化、及Western Blot法检测Trx-2的蛋白表达的变化.[结果]自体肝移植引起了大鼠明显的肝脏损伤,组织病理评分在移植后4h明显升高并达峰值,持续到移植后24 h(P＜0.05,vs.group S),但24 h较4h有明显改善(P＜0.05 vs.group LTR4h);O2·、·OH和MDA的生成在4h到16h增加明显(1.6 ～ 2.0倍),MDA水平发生与之一致的时间变化(P＜0.05 vs.group S);抗氧化酶活性在肝移植后4h和8h下降明显,SOD 、CAT和GSH活性下降达30％(P＜0.05 vs.group S),TOC活性下降达70％(P＜0.01 vs.group S).而相对氧化/抗氧化指标来讲,移植后肝脏组织内Trx-2蛋白表达增高的速度较慢,4h开始表达增加(P＜0.05 vs.group S),而直到24h才达到蛋白表达峰值(～2.0倍).[结论]移植后肝脏发生损伤,并逐渐加重而后逐渐恢复,损伤程度与活性氧水平和抗氧化酶活性变化趋势相一致;Trx-2的表达上调有利于抗氧化酶合成和提高抗氧化能力.
