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多囊蛋白1基因对人宫颈癌HeLa细胞的抗凋亡作用
目的:研究多囊蛋白1(PC1)对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,为进一步阐明PC1对凋亡的作用提供依据.方法:采用PC1基因重组质粒pEGPF-PC1-5TMC和空白对照质粒pEGFP分别转染HeLa细胞,Western blotting法进行验证.采用MTT法分别检测转染组(转染PC1重组质粒)、空白对照组(转染空白对照质粒pEGFP)和正常对照组(正常HeLa细胞)转染后48和72 h时细胞增殖活性,采用TUNEL法检测转染组和空白对照组细胞凋亡率.结果:转染后48和72 h,与正常对照组比较,转染组细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,转染组细胞增殖活性明显升高(P<0.05).转染组细胞凋亡率明显低于空白对照组(P<0.01).结论:PC1基因对人宫颈癌HeLa细胞有抗凋亡作用.
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多囊蛋白1胞内区单克隆抗体的制备及初步应用
目的:制备多囊蛋白1胞内区单克隆抗体,并用以观察多囊蛋白1在肾组织中的分布与表达.方法:以重组多囊蛋白1胞内段融合蛋白为抗原,采用杂交瘤技术,制备产生针对多囊蛋白1胞内区的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并利用所产生的单克隆抗体,采用标准EnVision免疫组织化学方法,对多囊肾组织、正常成人肾组织和胎肾组织进行染色.结果:获得4株稳定分泌抗体且效价为1∶106左右的杂交瘤细胞株,传代至第50代仍能稳定分泌抗体,效价不变;多囊蛋白1在正常成人肾组织的近端小管、远端小管和集合管的上皮细胞呈弱阳性表达,在胎儿肾脏的肾小管上皮细胞呈强阳性,在多囊肾组织的囊肿衬里上皮细胞表达明显增强.结论:成功制备了多囊蛋白1胞内区单克隆抗体,为深入了解多囊蛋白1的结构和功能提供了一个有用的工具.
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多囊蛋白1表达载体的构建及表达
目的:体外表达并纯化多囊蛋白1胞外区片段.方法:提取健康人肾组织总RNA,用一步法RT-PCR选择扩增编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的2个cDNA片段,并将之克隆到融合蛋白表达载体pQE30中,转染含有阻遏质粒pREP4的大肠杆菌M15.异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,用亲和层析法纯化.纯化产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质印迹分析鉴定.结果:克隆到2个编码多囊蛋白1胞外区的cDNA片段,其大小分别为502 bp和471 bp.构建的表达质粒pQE30-PKD1e1和pQE30-PKD1e2经限制性内切酶酶切和DNA测序证实为所需要的质粒.表达出相对分子质量分别为19 800、18 900的融合蛋白,经蛋白质印迹分析鉴定为多囊蛋白1的融合蛋白.结论:本实验克服了PKD1基因在体内多个同源序列的干扰,克隆了编码多囊蛋白1胞外多拷贝区的cDNA序列,并成功地获得了融合表达的目的蛋白,为进一步制备抗多囊蛋白1胞外区的抗体创造了条件.
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多囊蛋白1氨基段融合蛋白对肾小球系膜细胞细胞外基质及其降解基因表达的影响
目的 研究多囊蛋白-1氨基段(PC-1NF)融合蛋白对大鼠肾小球系膜细胞(RMC)Ⅳ型胶原及其降解调控基因表达的影响.方法 用实时荧光定量RT-PCR法检测PC-1NF融合蛋白对RMC Ⅳ型胶原和细胞外基质(ECM)降解调控基因基质金属蛋白酶、金属蛋白酶1组织抑制剂(MMP-2、TIMP-1)表达的作用.ELISA方法检测培养的细胞上清液中Ⅳ型胶原含量的变化.免疫细胞化学方法观察融合蛋白对细胞核因子c-jun和c-fos表达的影响.Western印迹检测融合蛋白对蛋白激酶C(PKC)-α信号转导通路的影响.结果 4 mg/L PC-1NF融合蛋白作用48 h后,RMCⅣ型胶原mRNA从(103±16)降至(82±11)拷贝/106 GAPDH,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),培养上清液中的IV型胶原含量也明显降低;MMP2 mRNA从(1150±90)升至(2770±170)拷贝/106 GAPDH,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),而TIMP-1 mRNA从(5530±480)降至(3040±370)拷贝/106 GAPDH,与对照组差异有统计学意义(P＜0.01).DAB染色显示,融合蛋白作用后,RMC的c-jun和c-fos表达受到明显抑制.RMC经不同浓度PC-1NF融合蛋白作用48 h后,随着融合蛋白浓度升高,PKC-α的表达逐渐减弱.结论 PC-1NF融合蛋白可通过上调促进ECM降解的MMP-2和抑制ECM降解的TIMP-1之间的比值而促进Ⅳ型胶原降解;还可能通过PKC-α信号转导通路,抑制c-jun和c-fos表达,从而抑制RMC的增殖和ECM的合成.
关键词： 常染色体显性多囊肾病 细胞外基质 多囊蛋白1 系膜细胞 -
多囊蛋白1氨基端肽对常染色体显性多囊肾囊肿衬里上皮细胞增殖和凋亡的影响
目的探讨多囊蛋白1氨基端肽(PC-1NTP)对常染色体显性多囊肾病(ADPKD)肾囊肿衬里上皮细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响.方法用噻唑蓝(MTT)法检测PC-1NTP对ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖的影响.用流式细胞仪分析细胞周期与凋亡状况.用荧光定量PCR检测细胞中细胞周期素cyclinD1、p21WAF1、bax、bcl-2和小染色体维护蛋白2(MCM-2)的mRNA表达.结果PC-1NTP使ADPKD囊肿衬里上皮细胞G0/G1期细胞百分比显著增多,S期细胞百分比显著减少,并明显抑制其增殖和凋亡;同时细胞中p21和bcl-2 mRNA表达明显增高(P＜0.01),cyclinD1、bax和MCM-2的mRNA表达明显减弱(P＜0.01或P＜0.05).结论PC-1NTP能明显抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞的增殖和凋亡,减慢细胞周期进程,其作用机制可能是通过调节G1/S关卡调节因子cyclinD1/p21WAF1和凋亡调节蛋白bcl-2/bax的表达实现的.PC-1NTP有希望成为治疗ADPKD的可选药物.
关键词： 常染色体显性多囊肾病 细胞周期 多囊蛋白1 -
抗多囊蛋白1氨基端单克隆抗体的制备和鉴定
目的:用杂交瘤技术制备抗多囊蛋白1胞外区氨基端的单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定.方法:以肾组织总RNA为模板,用RT-PCR扩增多囊蛋白1胞外区氨基端的编码基因PKD1 cDNA.将该基因克隆到融合蛋白表达载体pQE30中,转染大肠杆菌M15.以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达多囊蛋白1胞外区氨基端的组氨酸融合蛋白(PC1-e2),用亲和层析法纯化.以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0进行细胞融合,间接ELISA筛选阳性克隆,有限稀释法进行单克隆化.mAb的特异性用间接ELISA和Western blot鉴定.结果:克隆到两个编码多囊蛋白1氨基端的cDNA片段(502 bp和471 bp).构建的表达质粒经酶切和DNA测序证实,为所需要的质粒.表达出相对分子质量(Mr)分别为19 800和18 900的融合蛋白,经Western blot鉴定,均为多囊蛋白1的融合蛋白.用Mr为18 900的融合蛋白免疫小鼠,得到杂交瘤细胞株7B1.Western blot分析表明,该细胞株分泌的mAb能特异地与多囊蛋白1氨基端结合.结论:本实验表达了PKD1多拷贝区所编码的PC1-e2,成功地制备了抗多囊蛋白1胞外区N端的mAb.
关键词： 常染色体显性多囊肾病 多囊蛋白1 多拷贝区 单克隆抗体 -
钙信号在人类多囊肾病中的作用
多囊肾疾病是由于两种新的蛋白质,即多囊蛋白l和多囊蛋白2中的任意一种功能丧失所致.近期的研究表明,细胞内钙在肾的发育过程中起重要作用,同时研究确认钙信号通路的缺陷是多囊肾疾病中囊肿形成的基础,而多囊蛋白1和多囊蛋白2对细胞内的钙浓度有很大影响.
关键词： 钙 多囊蛋白1 多囊蛋白2 常染色体显性遗传性多囊肾病
