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明日叶查尔酮对胰岛素抵抗细胞PI3K-Akt-GLUT4信号通路的影响
目的 研究明日叶查尔酮(Angelica keiskei chalcones,AC)对胰岛素抵抗L6细胞磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶-葡萄糖转运体4(PI3 K-Akt-GLUT4)信号通路的影响.方法 采用高浓度胰岛素诱导的胰岛素抵抗L6细胞,分别加入5、10、20μmol/L终浓度的明日叶查尔酮共同培养24 h,葡萄糖氧化酶法测定细胞上清液中葡萄糖含量,逆转录聚合酶链式反应方法检测细胞PI3K和Akt的mRNA表达水平,蛋白印迹法检测GLUT4和Akt的蛋白表达水平.结果 胰岛素抵抗组细胞培养液的葡萄糖含量显著高于空白对照组(P＜0.05),而PI3K mRNA、Akt mRNA和GLUT4、Akt蛋白表达水平则降低(P＜0.05);中、高剂量AC组细胞培养液葡萄糖含量均低于胰岛素抵抗组(P＜0.05),而PI3K mRNA、Akt mRNA和GLUT4、Akt蛋白表达水平则升高(P＜0.05).结论 明日叶查尔酮可上调L6细胞胰岛素抵抗模型PI3K-Akt-GLUT4信号通路的表达水平,增强其对葡萄糖的摄取利用,改善胰岛素抵抗.
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肿瘤坏死因子-α诱导大鼠L6细胞胰岛素抵抗模型的建立
目的 采用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)体外诱导培养法建立大鼠骨骼肌细胞胰岛素抵抗(IR)模型,为研究IR的发生机制及筛选改善IR的药物和功能食品提供一种简便可靠的IR细胞模型.方法 以大鼠肌细胞系L6细胞为研究对象,在含10ng/ml小鼠TNF-α培养液中培养24h,同时设立空白对照组和胰岛素对照组.之后各组细胞分别加入100nmol/L胰岛素.采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)法检测培养液中残存葡萄糖含量,[3H]标记的脱氧葡萄糖转运检测细胞内葡萄糖的摄取量评价模型建立的效果.结果 在无胰岛素刺激下,TNFα诱导组培养液中残存葡萄糖含量和细胞内的葡萄糖摄取量,与空白对照组比较没有差异(P>0.05);在胰岛素刺激下,TNFα诱导组培养液中残存葡萄糖含量和细胞内的葡萄糖摄取量,与胰岛素对照组比较差异具有显著性(P<0.05).结论 用舍10ng/ml TNFα的培养液培养24h的L6细胞产生胰岛素抵抗,作为IR肌细胞模型可广泛用于胰岛素抵抗的机制研究和筛选辅助降血糖的药物或功能食品的功能评价.
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五羟色胺-N-乙酰转移酶基因真核表达载体的构建表达及活性检测
目的 构建pTARGETTM-AANAT真核表达载体并转化L6成肌细胞,检测目的基因的表达并初步探讨AANAT转基因细胞的生物活性.方法 提取大鼠松果体组织mRNA,RT-PCR技术扩增五羟色胺-N-乙酰转移酶基因(AANAT)cDNA,酶切连接pTARGETTM载体,脂质体法导入L6成肌细胞.倒置显微镜观察转化细胞体外存活、RT-PCR及Western blotting技术检测pTARGETTM-AANAT的基因表达产物及转化细胞的功能表达. 结果 酶切分析、DNA测序及凝胶电泳检测结果证实,pTARGETTM-AANAT真核表达载体构建成功.RT-PCR及Western blotting检测表明,转化后的L6细胞表达AANAT mRNA,细胞具备AANAT蛋白的表达能力.结论 成功构建pTARGETTM-AANAT的真核表达载体,转化的L6细胞株能表达AANAT蛋白活性.
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铁调素对体外培养大鼠骨骼肌细胞铁代谢的影响
目的 探讨铁调素对骨骼肌铁代谢的调节机制.方法 培养大鼠骨骼肌L6细胞,随机分成4组,每组6个重复,每组各加入不同浓度的铁调素溶液(终浓度分别为0、0.05、0.1、0.15 mg/L)孵育12h,采用同位素示踪法,用55Fe测定细胞铁摄取及铁释放能力的变化;通过流式细胞仪检测细胞内铁池(LIP)铁含量;应用免疫印迹法检测膜铁转运蛋白1(FPN1)的变化.结果 与空白对照组比较,0.1mg/L 铁调素处理组肌细胞的铁释放能力明显下降(P<0.05),0.05及0.15mg/L铁调素处理组肌细胞的铁摄取和铁释放均无明显变化(P>0.05);0.1mg/L 铁调素处理组其细胞内LIP铁含量较对照组明显升高(P<0.05);0.1mg/L 铁调素处理组细胞膜上FPN1的表达较对照组明显降低(P<0.05).结论 铁调素可通过影响骨骼肌细胞FPN1的表达水平,降低骨骼肌细胞内铁的向外转运,增加细胞内铁池的铁含量,从而调节骨骼肌细胞的铁代谢.
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氯喹通过Akt/PI3K和PKC信号通路促进GLUT4转运
目的 寻找能有效治疗糖尿病的新药物.方法 在荧光蛋白IRAP-mOrange稳定表达的L6细胞内,使用激光共聚焦显微镜监测氯喹作用下GLUT4(葡萄糖转位蛋白4)的转位和细胞内Ca2+水平的变化.结果 氯喹对L6细胞GLUT4转位有显著的促进作用.G?6983(PKC的抑制剂)和Wortmannin(PI3K的抑制剂)能够抑制氯喹诱导的GLUT4转位上膜.同时,Wortmannin能够降低氯喹刺激的L6细胞内Ca2+的增加,然而G?6983则对氯喹引起的L6细胞内Ca2+的增加没有影响.结论 氯喹通过Akt/PI3K和PKC通路增强L6细胞内GLUT4转运.同时,它诱导的胞内Ca2+的增加能促进GLUT4与细胞质膜的融合.氯喹可能具备开发成一种新的降血糖药物的潜力.
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委陵菜黄酮衍生物促进L6细胞GLUT4的转位活性
目的:筛选出具有促进骨骼肌细胞L6表面GLUT4转位活性的委陵菜黄酮衍生物.方法:将实验细胞分成空白对照组,胰岛素组(以胰岛素刺激20 min)和黄酮衍生物组(加不同衍生物刺激24 h),用类ELISA法测定细胞膜上GLUT4的量.结果:对黄酮衍生物1～14影响L6大鼠骨骼肌细胞GLUT4转运的实验结果表明,衍生物1、5、6、8～11在10 μg/mL作用浓度下,促进GLUT4转位的量分别为空白对照组的(3.60±0.30)倍、(3.66±0.26)倍、(2.87±0.49)倍、(3.97±0.37)倍、(2.82±0.45)倍、(3.37±0.67)倍、(4.43±0.61)倍(P＜0.05).化合物6与胰岛素叠加作用为空白对照组的(4.31±0.22)倍(P＜0.05).结论:委陵菜黄酮衍生物促进GLUT4转位的作用为首次报道.黄酮衍生物1、5、6、8～11有明显地促进L6表面GLUT4转位的作用;化合物6与胰岛素有协同作用.
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姜黄素对高糖诱导的L6细胞线粒体功能障碍的改善作用
考察姜黄素对高糖诱导的I6细胞线粒体功能障碍的改善作用.采用40 mmol/L葡萄糖处理24 h,建立L6细胞线粒体功能障碍模型,姜黄素受试浓度分别为10、20、40 μmol/L.结果显示,高糖培养可引起L6细胞线粒体功能出现明显障碍,主要表现为明显的线粒体膜电位降低、活性氧增多、ATP含量减少,线粒体生物合成(mtDNA数量)部分下降,同时UCP2、PGC-1α和Sirt3 mRNA和蛋白表达下调.姜黄素对于高糖所致线粒体功能障碍(膜电位下降,活性氧增多、ATP含量减少)具有明显的改善作用,同时升高UCP2的mRNA和蛋白表达,对于线粒体生物合成(mtDNA数量)未见明显影响.本研究提示姜黄素可能是通过多种途径的抗氧化作用而发挥线粒体保护作用.
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人胰淀素类似物普兰林肽体外活性测定方法的建立
建立体外人胰淀素类似物普兰林肽活性测定的方法,为普兰林肽及其制剂的质量控制提供可靠的细胞检测方法.将L6细胞培养并分化成有明显肌管的成熟骨骼肌细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测普兰林肽对高糖培养环境下骨骼肌细胞葡萄糖吸收的影响.结果显示,在1×10-9～1×10-5 mol/L的浓度范围内,普兰林肽能显著增加分化后的L6细胞的糖吸收量,在16h达到大值.普兰林肽浓度的负对数(x)与细胞糖吸收增加量(y)间呈现出良好的线性关系(y=-4.750x+ 59.54,R2 =0.991 9).应用本实验建立的方法检测了市售普兰林肽醋酸盐注射剂的活性,结果显示1×10-6、1×10-7和1×10-8 mol/L的普兰林肽注射剂作用于分化的L6细胞16h,细胞的糖吸收增加率为(61.89±9.54)％,(43.68±10.06)％和(33.30±13.03)％(P＜0.01)；与单用胰岛素组对比,普兰林肽与胰岛素联合使用能显著提高分化后的L6细胞的糖吸收量(P＜0.05),与普兰林肽注射剂的临床使用结果一致.本实验为普兰林肽的活性测定提供了一种稳定可靠的细胞替代模型.
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紫心甘薯黄酮改善 L6细胞胰岛素抵抗的有效部位筛选
目的：采用L6细胞胰岛素抵抗模型，筛选出能有效改善胰岛素抵抗的不同极性紫心甘薯黄酮提取液，并初步探讨其作用机制。方法：建立L6细胞胰岛素抵抗模型，采用不同极性的紫心甘薯黄酮提取液进行干预，观察并比较加液前后的细胞胰岛素抵抗L6细胞的剩余葡萄糖量。结果：紫心甘薯总黄酮提取液、正丁醇提取液中、高剂量组，氯仿提取液低、中、高剂量组葡萄糖剩余浓度明显小于IR组（P＜0．05）。结论：紫心甘薯总黄酮提取物、氯仿萃取液、正丁醇萃取液均具有缓解L6细胞胰岛素抵抗的作用。
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AANAT基因转染成肌细胞及其微囊化研究
目的:构建pTARGETTM-AANAT真核表达载体并转化L6成肌细胞,检测目的基因的表达;制备pTARGETTMMAANAT转基因细胞微囊,初步探讨AANAT转基因细胞微囊的生物活性.方法:RT-PCR技术扩增大鼠AANAT cDNA,酶切连接pTARGETTM载体,脂质体法转染L6细胞并检测pTARGETTM-AANAT的基因表达产物;将高表达活性的L6细胞进行APA微囊化处理,倒置显微镜观察微囊形态,Western-blot检测囊内细胞AANAT蛋白表达活性.结果:酶切、DNA测序及凝胶电泳检测结果证实,pTARGETTM-AANAT真核表达载体构建成功.转染后的L6细胞表达AANAT mRNA,胞浆中能检测到从NAT蛋白的表达.转染细胞微囊体外存活良好,微囊外形完整无粘连,大小较均一,囊内细胞清晰可见,体外培养两周后破囊检测证实囊内细胞具有AANAT蛋白表达活性.结论:pTARGETTM-AANAT真核表达载体在L6细胞中成功表达,转染细胞微囊体外存活良好,囊内细胞具备AANAT蛋白表达活性.
关键词： AANAT L6细胞 pTARGETTM载体 APA微囊
