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人类白细胞抗原A表达沉默对大鼠脑内人细胞移植排斥反应的调节
背景:移植物主要组织相容性抗原复合物在移植排斥反应中起关键作用.用慢病毒介导的人类白细胞抗原RNA干扰技术可以降低T淋巴细胞的细胞毒作用和抗体介导的溶细胞作用,但尚未见相关体内研究报道.目的:拟用携带人类白细胞抗原A小分子干扰RNA序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞,再将其移植到帕金森大鼠纹状体,观察人类白细胞抗原A表达沉默对移植排斥反应的调节.设计、时间及地点:细胞基因工程体内实验,于2005-09/2008-01在首都医科大学神经科学研究所完成.材料:清洁级12周龄雌性SD大鼠33只,用于建立帕金森动物模型.原代培养的人胚肺成纤维细胞取材于12周流产人胚胎,由北京京北医院提供.293T为贴壁依赖型成上皮样细胞.慢病毒载体系统由pSicoR,pCMV-VSV-G和psPAX2三质粒组成,为美国Addgene公司产品.携带HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA质粒由比利时Ludwig肿瘤研究所Pierre van Bruggen教授惠赠.方法:以携带HLA-A2 cDNA的pcDNA I/Amp-HLA质粒为模板PCR扩增HLA-A2 cDNA编码区序列,构建人类白细胞抗原A融合蛋白表达载体pEGFP-Flag-HLA,转染293T细胞.用HLA-A2编码区序列设计小分子干扰RNA 4个待选靶点序列,分别起始于编码区的第257,350,833,251位碱基,构建表达小分子干扰RNA慢病毒载体.用带有Flag标签的人类白细胞抗原A cDNA表达载体转染293T细胞后,再进行不同靶点病毒直接感染.33只帕金森模型大鼠随机分为2组,实验组大鼠纹状体植入人类白细胞抗原A小分子干扰RNA病毒感染的人胚肺成纤维细胞,对照组植入带有小分子干扰RNA对照序列和绿色荧光蛋白病毒感染的人胚肺成纤维细胞.主要观察指标:免疫组织化学染色检测脑内移植物人类白细胞抗原A、CD4和CD8的表达,用抗人细胞核的阳性表达评价移植细胞的存活情况.结果:与对照组比较,实验组移植后4d、2周时人类白细胞抗原A阳性细胞均较少(t=3.301,2.63l,P<0.01,0.05),6周时无明显变化:CD4阳性细胞仪移植后6周明显减少(t=2.269,P<0.05):移植后4 dCD8阳性细胞无明显变化,2周及6周时明显减少(t=2.333,P<0.05);抗人细胞核阳性细胞仅移植后2周明显减少(t=2.952,P<0.05).结论:人类白细胞抗原A表达敲减可以抑制移植排斥反应,但并不能显著延长移植物的存活时间.
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HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测
背景：人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是人的主要组织相容性复合物，在移植排斥反应中起关键作用。降低HLA的表达，可以延长移植物的存活时间。
目的：设计HLA-A2小干扰RNA，检测其对HLA-A2表达沉默的作用。
方法：设计4种HLA-A2 siRNA靶点序列构建其慢病毒表达体系，体外感染HLA-A过表达的293T细胞，观察4种靶点的敲减效率并筛选出有效靶点序列。体外培养人胚肺成纤维细胞，并用携带目的干扰序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞，荧光显微镜下观察感染效率，应用 Western blot 检测在人胚肺成纤维细胞中对HLA-A2表达沉默的作用。
结果与结论：根据Genbank中HLA-A2的mRNA序列，设计合成了3个小干扰RNA，在体外能有效的沉默HLA-A2在293细胞中的表达，将基因序列亚克隆入干扰载体后感染人胚肺成纤维细胞，也能有效的沉默HLA-A2的表达，效率达80%左右。 -
肿瘤抗原 PIWIL2的 HLA-A2限制性 CTL 表位鉴定
目的：鉴定肿瘤抗原PIWIL2的人类白细胞抗原A2（HLA-A2）限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位。方法：首先运用RT-PCR、Western blot方法检测PIWIL2在肿瘤细胞系MCF-7、SW480和HT-29中的表达情况，然后通过BIMAS、RankPep、NetMHC、NetCTL1.2及IEDB软件预测打分来选取PIWIL2的HLA-A2限制性的表位。候选表位肽通过标准的Fmoc化学合成法合成，结合力实验用于检测候选表位与T2A2细胞表面HLA-A2分子的结合能力，ELISPOT实验检测候选表位肽诱导CTL分泌IFN-γ的能力，体外细胞毒性实验检测候选肽诱导CTL的能力。结果：PIWIL2在肿瘤细胞系MCF-7、SW480和HT-29中均有表达。候选肽P485、P493、P965具有中等结合力。 ELISPOT实验结果显示表位肽P485和P965诱导的CTL具有分泌IFN-γ的能力。细胞毒性实验结果显示表位肽P485和P965对MCF-7细胞均有一定的杀伤作用。结论：表位肽P485和P965是优秀的PIWIL2抗原HLA-A2限制性CTL候选表位，可能成为新的抗肿瘤多肽免疫治疗疫苗的候选表位。
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MAGE-12的HLA-A2限制性CTL表位肽预测及其三维结构构建
目的 从理论上分析、预测黑色素瘤抗原(MAGE)-12的人类白细胞抗原(HLA)-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位肽,并构建其三维结构.方法 以肿瘤特异性抗原MAGE-12为研究目标,采用超基序法、量化基序法、多项式法、延展基序法与三维结构构建相结合的CTL表位预测方法.结果 预测出的MAGE-12的表位中有4个符合HLA-A2限制性CTL表位要求.结论 预测出的4个HLA-A2限制性CTL表位为MAGE-12的表位的可能性较大,经后续实验筛选、鉴定后,可用于基于MAGE-12的肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究.
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慢性 HBV 感染患者特异性细胞免疫功能与病毒载量的关系研究
目的：探讨慢性乙型肝炎病毒（HBV ）感染患者特异性细胞免疫功能与病毒载量的关系。方法选择51例慢性乙型肝炎患者（A组）、43例乙型肝炎肝硬化患者（B组）和40例体检健康者（C组）外，采用流式细胞术检测人类白细胞抗原A2（HLA-A2），采用 HLA-A2限制的 HBVcore18-27抗原表位肽五聚体（Pro5MHC）法检测Pro5MHC、CD8双阳性细胞[HBV特异性细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）]，并比较不同 HBV DNA水平患者各指标检测结果。结果 A组、B组HLA-A2阳性率均明显高于C组（P＜0．05）。随着 HBV DNA水平的升高，HBV特异性CTL水平逐渐减低（P＜0．05），但CD8＋细胞水平无明显变化（P＞0．05）。 HBV DNA水平大于105 copies／mL的患者，Pro5M HC／CD8＋水平明显低于 HBV DNA水平为103～105 copies／mL的患者以及HBV DNA水平小于103 copies／mL的患者（P＜0．05）。结论 HLA-A2是乙型肝炎肝硬化的易感基因之一。 HBV感染患者体内HBV特异性CTL水平随着病毒复制程度的升高而减低。Pro5M HC／CD8＋可作为判断病毒复制程度的客观指标。
