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大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定
目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.
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无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞
背景:传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制. 目的:拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞.方法:抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及鸶茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力.取传至4～6代的大鼠骨髓间充质千细胞.加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定. 结果与结论:P5骨髓间充质千细胞(91.5±3.1)%处于G1期.高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节.骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达.表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞:在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力.
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骨髓血管内皮祖细胞的分离培养及分化鉴定
目的 研究分离、培养小鼠骨髓血管内皮祖细胞的方法并对其进行诱导分化鉴定,为临床进行缺血性疾病的替代治疗奠定细胞学基础.方法 用灌注法分离小鼠骨髓血管内皮祖细胞,用血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子诱导其分化,形态学观察细胞的生长过程,并利用抗CD34抗体鉴定血管内皮祖细胞,利用抗vWF抗体、抗eNOS抗体鉴定血管内皮细胞. 结果小鼠骨髓血管内皮祖细胞可在体外培养条件下贴壁生长,可诱导分化为表达特异性组织蛋白的内皮细胞.结论 在小鼠骨髓内可分离出骨髓源性血管内皮祖细胞,呈贴壁增殖状态,并有分化能力.
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17β-雌二醇对骨髓源性内皮祖细胞归巢的影响
17β-雌二醇在体外能上调骨髓源性内皮祖细胞( BM-EPCs)表面CXCR4表达而促进其向基质细胞衍生因子(SDF)-1α迁移[1].我们在心肌梗死后SDF-1α表达高峰,经静脉移植超顺磁性氧化铁(SPIO)标记的经17β-雌二醇处理的BM-EPCs,以此评价17β-雌二醇对BM -EPCs归巢的影响.
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dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞Hes5表达的实验研究
目的观察外源性短双链RNA(dsRNA)在转录后水平即mRNA水平降低基因表达的效率,并对其影响因素进行初步探讨.方法将体外分离培养的大鼠骨髓基质细胞,通过由本实验室配制的特殊培养基诱导成神经干细胞,应用人工合成的dsRNA于不同浓度转染神经干细胞,Westem bloting检测dsRNA是否能阻断转录因子Hes5的表达,0.5%锥虫蓝法测定各浓度组中培养细胞活力.结果 200～300 nmol/L浓度的dsRNA能特异有效地阻断Hes5的表达,而50～200 nmo1/L浓度的dsRNA有利于干细胞存活.结论 dsRNA能在神经干细胞内启动RNA干扰作用,适宜浓度的dsRNA能在特异有效地阻断内源性基因的表达的同时,大限度地保持细胞活力.
关键词： 双链RNA Hes5 神经干细胞 骨髓源性 RNA干涉:免疫印迹
