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DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立
目的建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株,用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系.方法运用基因工程的方法获得hMSH2 cDNA片段,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞(HLF),使之在HLF中表达,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平.结果构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体,并在真核细胞成功表达;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了44%.结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段.
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二十碳五烯酸通过抑制MGMT表达提高胶质瘤U87细胞对替莫唑胺的化疗敏感性
目的 探讨二十碳五烯酸(EPA)对胶质瘤U87细胞替莫唑胺(TMZ)化疗敏感性的影响及其机制. 方法 (1)体外常规培养U87细胞,加入0、25、50、100、200 μmol/L EPA分别作用12、24、48 h后MTT检测细胞增殖率;(2)将U87细胞分为对照组、EPA组、TMZ组、EPA+TMZ组(EPA、TMZ的浓度分别为25、100 mol/L,EPA预处理时间为12、24或48 h,TMZ作用时间为24 h),MTT检测4组细胞的增殖抑制率;(3)将U87细胞分为对照组、EPA组、TMZ组、EPA+TMZ组(EPA、TMZ的浓度分别为25、100 mol/L,作用时间分别为12、24h).流式细胞术检测4组细胞凋亡率;Western blotting检测细胞活化半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,DNA错配修复酶(MGMT)及核因子κB(NF-κB) p65、NF-κB抑制蛋白(IKBα)的表达;免疫荧光染色检测细胞MGMT和NF-κB p65的表达;甲基化特异性PCR(MSP)法检测细胞MGMT基因启动子甲基化水平. 结果 (1)50、100、200μmol/L EPA作用12、24、48h时对U87细胞的增殖抑制呈浓度和时间依赖性;(2)与同样预处理时间的TMZ组比较,EPA+TMZ组U87细胞的增殖抑制率均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);(3)流式细胞术检测显示:与TMZ组[(34.58±4.35)％]比较,EPA+TMZ组U87细胞的凋亡率[(53.28±5.05)％]明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);Western blotting检测显示:与TMZ组比较,EPA+TMZ组U87细胞活化caspase-3、Bax和IKBα蛋白表达升高,MGMT和NF-κB p65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P＜0.05);免疫荧光染色显示EPA+TMZ组细胞MGMT和NF-κB p65蛋白的表达低于TMZ组;MSP检测显示EPA+TMZ组U87细胞MGMT基因启动子甲基化水平高于TMZ组. 结论 EPA预处理可提高胶质瘤U87细胞对TMZ的化疗敏感性,其机制可能是通过下调NF-κB信号通路抑制MGMT表达来实现.
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内质网应激诱导胶质瘤U87细胞替莫唑胺化疗抵抗
目的 探讨内质网应激对胶质瘤U87细胞替莫唑胺(TMZ)化疗敏感性的影响及其机制. 方法 (1)体外常规培养胶质瘤U87细胞,培养24h后加入0、12.5、25、50、100 μmol/L TMZ作用24h,MTT检测细胞增殖抑制率,观察TMZ的半抑制浓度(IC50;0、2、4、8μmol/L内质网应激诱导剂衣霉素(TM)处理U87细胞6h后加入50 μmol/L TMZ作用24 h,MTT检测细胞增殖抑制率的变化;(2)将细胞分为对照组、TM组、TMZ组、TM+TMZ组,TM组、TM+TMZ组细胞加入4μmol/L TM预处理6h,后2组细胞加入50 μmol/L TMZ,对照组加入等量培养基.继续作用24 h后流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;Westem blotting检测细胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、DNA错配修复酶(MGMT)、内质网腔内分子伴侣(GRP78)、磷酸化肌醇需要酶1(IRE-1)的表达. 结果 (1)MTT检测显示TMZ对U87细胞的IC50为50 μmol/L.与0μmol/L TM+50 μmol/L TMZ组、2μmol/L TM+50 μmol/L TMZ组比较,4 μmol/L TM+50 μmol/LTMZ组、8μmol/LTM+50 μmol/TMZ组细胞增殖抑制率均降低,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)与TMZ组比较,TM+TMZ组细胞凋亡率[(46.98±4.79)％vs.(35.74±4.09)％]明显减少,凋亡因子caspase-3和Bax蛋白的表达减少,MGMT、GRP78和IRE-1蛋白的表达增加,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 内质网应激可增加胶质瘤U87细胞耐药基因MGMT的表达,降低细胞对TMZ的化疗敏感性,诱发细胞产生化疗抵抗.
