首页 > 文献资料
-
Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响
目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.
关键词： 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 肾小管上皮细胞 反义RNA 重组腺病毒 -
白细胞介素2对淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶在肾小管上皮细胞中表达的影响
目的:探讨IL-2对肾小管上皮细胞中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck) mRNA及蛋白表达的影响以及Lck在狼疮肾炎中的致病作用.方法:采用BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞为实验对象,分别给予 IL-2(100 U/ml)刺激.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肾小管上皮细胞Lck mRNA的表达,免疫印迹法检测Lck蛋白的表达,比较IL-2刺激前后Lck mRNA及蛋白表达水平的变化.结果:正常BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞中仅有微量Lck mRNA及蛋白表达,经IL-2刺激后二者的Lck mRNA及蛋白表达水平均有增加,以狼疮小鼠肾小管上皮细胞增加更为显著.结论:(1)肾小管上皮细胞中有Lck基因的表达.(2)肾小管上皮细胞经IL-2刺激后Lck mRNA及蛋白表达水平增加,提示IL-2可活化肾小管上皮细胞诱导Lck表达,进而可能通过一系列信号传导作用,发挥生物学作用.相对于BALB/c小鼠,狼疮小鼠肾小管上皮细胞在IL-2刺激后Lck表达更明显,提示狼疮小鼠肾小管上皮细胞可能更易激活.(3)由于Lck在狼疮肾炎小鼠肾小管上皮细胞中异常表达,推测Lck可能作为细胞因子或炎症因子的重要信号分子,促进狼疮肾炎的发生.
关键词： IL-2 淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 肾小管上皮细胞 狼疮肾炎 -
乳酸杆菌脂磷壁酸通过下调脂筏中Lck激酶水平抑制大鼠肝脏Kupffer细胞TLR4通路
目的:探讨保加利亚乳酸杆菌脂磷壁酸(Lipoteichoic Acid of Lactobacillus bulgancus,LBG-LTA)是否能下调细胞膜脂筏中的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck),进而抑制大鼠肝脏Kupffer细胞Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)通路.方法:分离培养10只雄性Wistar大鼠的Kupffer细胞;培养LBG并制备LBG-LTA;有或无LBG-LTA、脂筏裂解剂甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrine,MβCD)、Lck抑制剂PP2分别预处理情况下,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激Kupffer细胞,提取各组细胞的膜-浆蛋白及核蛋白,蔗糖密度梯度离心法提取膜-浆蛋白中的脂筏及非脂筏组分,Western blot检测脂筏及非脂筏组分中TLR4、TANK结合激酶1(TANK binding kinase-1,TBK1)、Lck及核蛋白中的核因子B (nuclear factor-κB,NF-κB),酶联免疫吸附法检测培养上清中的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素1β(interleukin-1β,IL-1β).结果:LPS上调的TLR4、Lck主要在脂筏内(与对照孔脂筏相应数值之比为0.95 0.23 vs 0.0120.0023,1.05 0.26 vs 0.022 0.0052,P均＜0.05),TBK1主要在非脂筏组分中(与对照孔非脂筏组分数值之比1.02 0.21 vs 0.0480.011,P＜0.05),核蛋白中的NF-B及培养上清中的TNF-α和IL-1β亦明显升高(与对照孔相应数值之比为0.78 0.16 vs 0.0760.014,189.2 27.1 vs 5.62 0.82,131.6 18.8 vs 7.24 1.14,P均＜0.05).与MαCD或PP2一样,LBG-LTA也明显抑制LPS的作用(LTA+LPS孔脂筏中TLR4、Lck与LPS孔相应数值之比为0.15 0.036 vs 0.95 0.23,0.17 0.052 vs 1.05 0.26,非脂筏组分中TBK1与LPS孔的比较为0.25 0.062 vs 1.02 0.21,NF-B、TNF-α及IL-1β与LPS孔相应数值之比为0.17 0.035 vs 0.78 0.16,32.2 4.37 vs189.2 27.1,23.4 3.29 vs 131.6 18.8,P均＜0.05).结论:LBG-LTA下调大鼠Kupffer细胞膜脂筏中的Lck,进而抑制其TLR4通路.
