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VDAC1基因低表达型Z310细胞系的建立与乙酸铅对其增殖的影响
目的 运用载体介导的RNA干扰技术靶向抑制电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)在永生化大鼠脑脉络丛Z310细胞中的表达,构建VDAC1基因低表达型Z310细胞系,并检测乙酸铅对其增殖的影响,为进一步研究VDAC1蛋白在乙酸铅对Z310细胞毒性机制中的功能和作用提供实验基础.方法 利用分子克隆技术构建4种特异性VDAC1-miRNA (GFP)干扰载体,筛选、测序验证并扩增.通过Lipofectamine LTX转染试剂盒将重组质粒转染Z310细胞,转染24 h后,以荧光显微成像技术观察细胞的转染效果.经Blasticidin筛选后,通过实时荧光定量PCR法和蛋白印迹法(Western blotting)检测转染后细胞中靶基因和靶蛋白的表达情况.并采用CCK-8法检测乙酸铅(1、5、10、20、50、100、200和400 μmol/L)染毒24 h对VDAC1低表达Z310细胞增殖的影响.结果 本实验筛选出有效的干扰载体13MR0047-3-1,与空载体组比,其对靶基因的沉默效率为52.62％；与未处理的Z310细胞组比,其下调了81.28％ VDAC1蛋白的表达.CCK-8法结果显示,20 μmol/L以上剂量的乙酸铅可抑制VDAC1低表达Z310细胞的增殖,存在剂量-效应关系；且与相同染毒剂量组的空载体对照Z310细胞比,高剂量乙酸铅(200 ～ 400 μmol/L)对VDAC1低表达Z310细胞的毒性更大,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 大鼠脑脉络丛永生化Z310细胞电压依赖性阴离子通道1的靶向抑制成功,VDAC1基因低表达型Z310细胞系构建成功.VDAC1的低表达促使Z310细胞对乙酸铅的毒性作用更为敏感,其机制值得进一步研究.
关键词： 永生化Z310细胞 电压依赖性阴离子通道1 乙酸铅 增殖 -
大鼠电压依赖性阴离子通道1的基因克隆与序列分析
目的 克隆大鼠电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)基因,并应用生物信息学方法进行分析.方法 以提取的大鼠心肌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得VDAC1基因片段,连接到pMD19-T克隆载体并测序鉴定.应用生物信息学方法分析VDAC1基因的序列同源性与结构特征.结果 成功克隆了大鼠VDAC1基因,与人、牛、小鼠、兔和猪的VDAC1基因具有高度同源性,同源性分别为90.0%、90.6%、96.0%、91.1%和91.0%.VDAC1在体外哺乳动物网状细胞中的半寿期为30h,无卷曲螺旋结构,但有6个亲水区,在225～247aa具有真核细胞线粒体外膜孔道蛋白家族特征性模序结构.结论 成功克隆了大鼠VDAC1基因,并应用生物信息学技术进行序列分析,为进一步研究其生物学功能及其在2型糖尿病发病机制中的作用提供了依据和线索.
关键词： 电压依赖性阴离子通道1 2型糖尿病 基因克隆 生物信息学 -
VDAC1在富氢液减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用
目的 评价电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)在富氢液减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤中的作用.方法 雄性SD大鼠60只,体重280 ～ 320 g,采用随机数字表法,将其分为6组(n=10):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、富氢液组(H组)、二甲基亚砜溶剂对照组(DMSO组)、VDAC1阻断剂4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸组(DIDS组)和富氢液+DIDS组(HD组).采用经食管心脏起搏诱发室颤后心肺复苏建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型.H组和HD组于再灌注即刻和6h时腹腔注射富氢液5 ml/kg,I/R组腹腔注射等容量生理盐水;DIDS组和HD组诱发室颤前经15 min股静脉输注DIDS 12 mg/kg,次日9时腹腔注射DIDS 12 mg/kg;DMSO组诱发室颤前经15 min股静脉输注DIDS的溶剂DMSO 12 mg/kg,次日9时腹腔注射DMSO 12 mg/kg.于再灌注24h时行神经功能评分,然后处死大鼠,取海马组织,计数正常椎体细胞,采用Western blot法测定VDAC1蛋白、细胞色素c和活化的caspase-3表达水平,采用荧光探针法测定活性氧(ROS)的含量.结果 与S组比较,其余各组神经功能评分和正常锥体细胞计数降低,海马组织VDAC1蛋白、细胞色素c和活化的caspase-3表达上调,ROS含量升高(P＜0.05);与I/R组比较,H组、DIDS组和HD组神经功能评分和正常锥体细胞计数升高,海马组织VDAC1蛋白、细胞色素c和活化的caspase-3表达下调,ROS含量降低(P＜0.05),DMSO组上述各指标差异无统计学意义(P＞0.05);与H组比较,HD组神经功能评分和正常锥体细胞计数升高,海马组织VDAC1蛋白、细胞色素c和活化的caspase-3表达下调,ROS含量降低(P＜0.05).结论 富氢液通过抑制VDAC1的开放减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤.
关键词： 电压依赖性阴离子通道1 氢 再灌注损伤 脑 -
基于VDAC1/mPTP调节机制探讨葛根素抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用
目的 研究葛根素( puerarin, Pue)抗心肌缺血/再灌注损伤作用,及其可能涉及的线粒体机制.方法 建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧( anoxia/reoxygenation, A/R)损伤模型.构建VDAC1 重组质粒pFLAG-VDAC1.细胞随机分为4组,正常对照组(Control)、缺氧/复氧组(A/R)、葛根素组(Pue+A/R)、VDAC1高表达组(pFLAG-VDAC1-葛根素),采用Real-time PCR法检测VDAC1 mRNA的表达情况,West-ern blot法检测其蛋白水平.流式细胞术观察线粒体膜电位(Δψm)和细胞凋亡,自动生化分析仪检测LDH、CK活性,线粒体肿胀实验检测各组细胞线粒体通透性转换孔道( mito-chondria permeability transition pore, mPTP)的开放情况.结果 与Control组相比,A/R组VDAC1 mRNA及蛋白表达水平均上调,LDH、CK水平升高,Δψm崩溃,mPTP开放,细胞凋亡明显增多.葛根素预处理则可下调VDAC1 表达,维持Δψm,防止mPTP开放,减少细胞凋亡.转染VDAC1高表达载体pFLAG-VDAC1,可取消葛根素的保护作用.结论 葛根素抗A/R损伤作用与 VDAC1 密切相关,其可通过下调VDAC1,防止 mPTP 开放,从而减少细胞凋亡,保护心肌细胞.
关键词： 葛根素 缺氧/复氧损伤 细胞凋亡 电压依赖性阴离子通道1 线粒体通透性转换孔道 心肌细胞
