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重组人诱导型一氧化氮合酶转染平滑肌细胞及对其增殖的影响
目的探讨血管平滑肌细胞基因转染后对血管平滑肌细胞增殖的影响.方法将诱导型一氧化氮合酶基因通过真核表达载体转入血管平滑肌细胞中,用Griess法测定转染细胞生成的一氧化氮的量;观察对平滑肌细胞生长状态的影响,用流式细胞仪分析细胞周期的变化.
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Paxillin对骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的影响
目的:探讨Paxillin对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向类髓核细胞分化的影响.方法:取3周龄健康SD大鼠骨髓,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,传至第3代,用流式细胞仪对其表面标志分子进行鉴定.利用pcDNA3.1(-)/Myc-His B质粒构建真核表达载体pcDNA3.1-Paxillin.取第3代BMSCs分为3组:实验组,转染pcDNA3.1-Paxillin;阴性对照组,转染pcDNA3.1(-)/Myc-His B;空白对照组,不转染质粒.分别培养36h后,实验组和阴性对照经G418筛选,取3组BMSCs采用实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测各组Paxillin、蛋白多糖(Aggreean)、Ⅱ型胶原α1 (collagen typeⅡα1,COL2α1)、性别决定区Y框蛋白9(sex determining region Y box protein 9,SOX9)、角蛋白19 (keratin 19,KRT19)、配对盒1(paired box 1,PAX1)和叉头蛋白(forkhead box F1,FOXF1)的mRNA表达量;免疫印迹法(Western blot)检测Paxillin、KRT19、PAX1和FOXF1蛋白表达水平.结果:BMSCs原代培养至第3代的细胞形态大体一致,呈长梭形,细胞连接紧密且均匀分布,CD44、CD90呈现高表达(95.6％和96.8％),CD45、CD11则呈现低表达(1.82％和2.16％).实验组中Paxillin的mRNA和蛋白表达量较阴性对照组和空白对照组升高,差异具有显著性(R0.05);经G418筛选后的BMSCs和髓核细胞形态相似.实验组中COL2α1、SOX9、Aggreean、KRT19、PAX1、FOXF1的mRNA表达量较阴性对照组和空白对照组显著性升高(P＜0.05);实验组KRT19、PAX1和FOXF1的蛋白表达量显著性高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).结论:Paxillin可以促进BMSCs向类髓核细胞分化,为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗提供基础.
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分泌型凋亡素真核表达载体的构建及对肝癌细胞HepG2凋亡的影响
目的 构建含有NT4和HA2-TAT的分泌型VP3真核表达载体,并观察其表达对人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3的影响.方法 构建了含鸡贫血病毒VP3基因和NT4、HA2-TAT基因的分泌型真核表达载体--NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体.体外转染人肝癌细胞HepG2和小鼠成纤维细胞NIH3T3,用MTT法和流式细胞学,检测凋亡素融合基因诱导细胞凋亡的效果.结果 携带融合基因的重组腺相关病毒感染人肝癌HepG2细胞48 h后,显示了很强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力.而对小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞无明显凋亡作用.结论 分泌型NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体转染细胞后能够被正常分泌、穿膜并特异性诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤的基因治疗提供了新的思路.
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稳定表达乙肝病毒X蛋白肝癌细胞系的建立及其侵袭性研究
目的 构建稳定表达乙肝病毒X蛋白的CCL13细胞系,为研究HBx在诱导肝细胞癌侵袭和转移等生物学行为的作用提供基础.方法 将已构建的含HBx基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBx质粒,采用脂质体介导法转染到人肝CCL13细胞系并检测HBx的稳定表达.通过体内、体外实验,研究目的 细胞的侵袭能力.结果 应用PCR技术从已转染的CCL13细胞中克隆出HBx基因,检测有无稳定表达HBx基因的两组CCL13细胞生长曲线、集落形成率、划痕愈合和细胞侵袭力,发现转染细胞的生物学行为有很明显的恶性肿瘤细胞表型.结论 成功构建了稳定表达X蛋白且具有高侵袭性的CCL13细胞系,发现该细胞系侵袭能力的条件性.
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癌胚抗原嵌合锚定T细胞对胃癌的体内外抑癌效应观察
增强免疫水平对提高胃癌疗效十分重要,我们利用共刺激信号CD3ζ对T细胞的活化作用和抗癌胚抗原(CEA)单链抗体的识别功能,构建真核表达载体[1].在此基础上制备CEA阳性嵌合锚定T细胞,观察其对CEA阳性胃癌裸鼠的抑癌效应,以期探讨嵌合锚定T细胞对消化道肿瘤的治疗作用.
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bFGF基因转染对成骨细胞生物学行为的影响
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是调控成骨细胞增殖和分化的首选生长因子之一，而且还是一种强大的毛细血管增殖刺激剂。但外源性生长因子半衰期短，需反复给药，且价格昂贵[1,2]。我们将bFGF基因由体外转入兔骨膜源成骨细胞，观察了其对成骨细胞生物学的影响，报告如下。1．材料与方法：含有bFGF cDNA的克隆载体puc13-rbFGF由日本Inawashiro博士惠赠，用EcoR I酶切puc13-rbFGF及真核表达载体pcDNA3，用T4DNA连接酶连接后构建pcDNA3-bFGF重组表达质粒并鉴定。无菌条件下取2个月龄新西兰兔之双侧股骨和胫骨骨膜，37℃下用0．25％胰蛋白酶和0．1％I型胶原酶各消化30min及2 h，将分离细胞接种于50ml培养瓶，加入含15％胎牛血清、10-7 M地塞米松、50mg/L维生素C、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基，在37℃5％CO2培养箱培养，用钙钴法行碱性磷酸酶(ALP)染色对培养细胞进行鉴定。
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arresten对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的抑制作用的研究
目的探讨arresten抑制人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的作用.方法构建包含arresten cDNA的分泌型真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ss-arresten,并以脂质体法将重组质粒转染至SGC-7901细胞.蛋白印迹法(Western blot)检测SGC-7901是否分泌表达arresten,同时,通过生长曲线绘制及生长周期测定的方法了解上述转基因措施本身对SGC-7901细胞的体外生物学特性的影响.将转基因的SGC-7901细胞株接种至裸鼠皮下,使其在接种局部表达arresten,观察肿瘤生长情况.结果成功构建了分泌型真核表达载体pcDNA3.1(+)-ss-arresten,并获得了可分泌表达arresten的人胃癌SGC-7901细胞株.质粒转染对SGC-7901细胞增殖特性无影响.转基因SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤生长缓慢.结论 arresten抑制人胃癌SGC-7901移植瘤的生长,其途径可能是通过抑制其滋养血管的生长而实现.
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pcDNA 3.1/RPs15载体构建及对皮肤成纤维细胞作用的实验研究
目的构建核糖体蛋白s15(RPs15)基因真核表达载体,研究其对小鼠皮肤成纤维细胞的体外作用.方法将RT-PCR法获得的鼠胚皮肤RPs15cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),在FuGENE6介导下转染体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞,观察RPs15基因的表达情况及其对成纤维细胞生物学特性的影响.结果构建的重组表达载体pcDNA3.1/RPs15经DNA测序证实序列正确.RT-PCR法检测RPs15基因在转染的成纤维细胞中获得表达,细胞生长密度下降,形态发生变化.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/Rps15,并可在体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞中表达,为深入研究RPs15基因对皮肤成纤维细胞的作用奠定了基础.
关键词： 核糖体蛋白s15基因 真核表达载体 成纤维细胞 基因表达 -
AP-2α对滋养细胞凋亡、侵袭作用的影响
目的 研究转录因子激活蛋白-2α(Transcription factor activator protein-2 α,AP-2α)对滋养细胞BeWo凋亡、侵袭等生物学功能的影响,探讨在子痫前期(preeclampsia,PE)发生发展中的作用.方法 将已构建的pIRES2-EGFP/AP-2α真核表达载体,采用瞬时转染的方法转入滋养细胞系BeWo细胞中,应用real time-PCR及Western blot方法,检测各组BeWo细胞中AP-2αmRNA及蛋白表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell法检测转染后各组细胞侵袭力.结果 AP-2α转染BeWo细胞后AP-2αmRNA和蛋白表达量较对照组显著增加,其差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:与对照组比较,AP-2 α转染组细胞凋亡数量明显增多,差异有统计学意义(P＜ 0.05);Transwell检测细胞侵袭能力实验结果显示:与对照组比较,AP-2α转染组细胞侵袭的数量显著减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 证明AP-2α促进滋养细胞凋亡并降低其侵袭力,造成滋养细胞层浅表植入,从而为子痫前期致病机理研究提供了理论依据.
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THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究
目的 构建THY1基因真核表达载体,并转染卵巢癌细胞株SKOV3,观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响.方法 本研究于2005年3月至2007年3月通过目的 基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3.1(+)-THY1,转染SKOV3(SKOV3-THY1组),同时设空载体转染组(SKOV3-Null组)和空白对照组(SKOV3组),甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化;并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型,观察瘤体生长速率.结果 PCR、酶切及DNA测序证实,THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1(+),RT-PCR和蛋白质斑迹法(Western blot)证实重组载体已整合于SKOV3;SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组(P<0.05);建立裸鼠致瘤模型4周后,SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低(P<0.05).结论 THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖,THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用.
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MALAT-1基因种属同源序列重组质粒的构建及其与人鼻咽癌细胞株C666-1侵袭转移的关系
目的:运用基因重组技术构建人MALAT-1基因种属同源序列(Species homologous fragments/shf)重组真核荧光表达载体,并探讨其在MALAT-1高表达的人鼻咽癌细胞株C666-1中的表达和对其侵袭转移的影响.方法:应用RT-touchdown PCR的方法,从鼻咽癌患者正常切缘组织中扩增出MALAT-1基因的种属同源序列,将所得的cDNA序列定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1质粒中,构建出重组真核荧光表达载体;采用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒pEGFP-C1-MALAT-1/shf瞬时转染MALAT-1高表达的人鼻咽癌细胞株C666-1;通过实时荧光定量PCR方法检测MALAT-1基因种属同源序列转染组和空载体转染组细胞中MALAT-1/shf的表达水平;细胞基质胶侵袭实验研究转染组细胞侵袭能力的变化.结果:经酶切鉴定及测序分析,证实成功构建人MALAT-1/shf重组真核荧光表达载体.PEGFP-C1-MALAT-1/shf(6918～8441 bp)转染组平均侵袭细胞数(51.20±5.933)显著高于MALAT-1/mock组(13.40±3.847),差异具有统计学意义(P=0.000).这说明转染pEGFP-C1-MALAT-1/shf(6918～8441 bp)重组质粒后,细胞的侵袭能力明显增强.结论:成功构建了人MALAT-1基因种属同源序列真核荧光表达载体 pEGFP-C1-MALAT-1/shf,并成功在MALAT-1高表达的人鼻咽癌细胞株C666-1中表达,MALAT-1/shf(6918～8441 bp)与人鼻咽癌C666-1细胞株的侵袭转移密切相关.
关键词： 人肺腺癌转移相关转录本1 种属同源序列 真核表达载体 鼻咽肿瘤 -
人微管不稳定蛋白基因真核表达载体的构建与表达及对食管癌细胞的作用
目的 构建人微管不稳定蛋白基因(stathmin)真核表达载体,研究其对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增stathmin cDNA,克隆至pMDl8-T载体并酶切鉴定后,亚克隆至pEGFP-C2真核表达载体.将测序鉴定正确的重组载体和空载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察转染细胞荧光蛋白的表达,采用Western blot检测转染细胞中增强型荧光蛋白(EGFP)和stathmin融合蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪分析细胞的增殖状态,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定后获反向插入质粒;亚克隆至pEGFP-C2载体后,经酶切与测序鉴定,重组载体pEGFP-stathmin构建成功.重组载体和空载体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株.通过荧光显微镜观察到,转染细胞中呈现绿色荧光;经Western blot证实,重组载体表达46 000的融合蛋白.与空载体转染细胞相比,转染重组载体的EC9706细胞形态变大,增殖速度减慢,细胞分裂阻滞于G2/M期,细胞克隆形成数减少,裸鼠体内成瘤性降低(P＜0.05).结论 构建的真核表达载体pEGFP-stathmin在食管癌EC9706细胞中能够稳定表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和成瘤性.
关键词： 人stathmin基因 真核表达载体 EC9706细胞 -
MDR1基因短发卡样RNA表达载体逆转K562/A02人白血病细胞多药耐药的研究
目的 构建MDR1基因短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,观察对K562/A02人白血病细胞株MDR1基因的沉默作用以及对P-糖蛋白(P-gp)表达及功能的影响.方法 以基因重组技术构建表达质粒,转染重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B至K562/A02细胞株,通过半定量RT-PCR和蛋白质印迹法,检测MDR1基因表达及P-gp表达水平的变化;以MTT法检测阿霉素(ADM)对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);高效液相色谱(HPLC)法检测细胞内ADM含量.结果 构建的2种重组质粒pEGFP-C1/U6/MDR1-A和pEGFP-C1/U6/MDR1-B均明显抑制K562/A02细胞株MDR1基因表达,抑制率高为48.2%±2.5%;同时抑制P-gp蛋白的表达,抑制率高为50.67%.对ADM药物敏感性的相对逆转效率分别为40.8%和62.4%;同时使K562/A02细胞内ADM含量增加.结论 shRNA表达载体可明显抑制K562/A02细胞MDR1 mRNA的转录和P-gp蛋白的表达,增加K562/A02细胞内ADM含量,恢复K562/A02细胞对化疗药物的敏感性,逆转MDR1基因编码蛋白P-gp介导的多药耐药.
关键词： MDR1基因 真核表达载体 K562/A02人白血病细胞株 P-糖蛋白 多药耐药 -
PEA-15真核表达载体的构建及表达
目的 构建PEA-15真核表达载体pcDNA3.1-PEA-15,并在人类食管癌细胞(EC-109)中表达.探讨PEA-15对EC-109细胞的影响.方法 采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达.构建重组真核表达载体pcDNA3.1-PEA-15.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测基因及蛋白表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率.结果 RT-PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达.PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3.1-PEA-15构建成功.转染后的细胞中PEA-15表达均增加(t值分别为4.078、5.269,均P＜0.05).转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[(7.12±0.86)％、(12.55±1.78)％,t=6.163,P＜0.05].结论 成功构建重组真核表达载体pcDN A3.1-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生.
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靶向人Trb3基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定
目的 构建并鉴定靶向果蝇同源蛋白3(tribbles-related protein 3,Trb3)基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,并检测其对靶基因的沉默效应.方法 根据Genbank数据库中Trb3序列,设计、合成3对互补并特异性编码其shRNA序列的寡核苷酸,克隆到线性化的pSUPER.retro.puro质粒载体中,并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒和pSUPER.retro.puro Vector转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株,RT-PCR和Western-Blot检测其对靶基因Trb3的表达影响.结果 酶切及测序鉴定重组质粒pSUPER.puro-shTrb3序列正确;转染重组质粒后舌鳞状细胞癌Tca113细胞中Trb3 mRNA和蛋白表达水平相对于空载体组明显下降,shRNA可以特异性沉默Trb3基因.结论 成功构建了靶向人Trb3基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究Trb3在舌鳞状细胞癌和其他头颈肿瘤中的作用奠定了基础.
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大鼠FOXP3基因的克隆及真核表达载体的构建
目的 构建大鼠F0XP3真核表达载体,为转基因治疗角膜移植免疫排斥反应提供实验基础.方法 采用RT-PCR技术从SD大鼠脾脏扩增FOXP3基因,EcoRI、xhoI双酶切peDNA3.1载体和FOXP3,DNA连接酶连接,构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体,测序鉴定.结果 从大鼠脾细胞中成功克隆获得了1290bp的FOXP3基因,测序结果表明正确构建了含有FOXP3基因的pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体.结论 成功构建了真核表达载体pcLDNA3.1-FOXP3,为进一步研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础.
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纤维粘连蛋白片段真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDA的构建
目的 构建纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)基因的EDA外显子的真核表达载体,以研究EDA对涎腺腺样囊性癌(slivary adenoid cystic carcinoma,SACC)生物学行为的影响.方法 以RT-PCR技术从口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma)细胞株KB中扩增出外显子EDA,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,用PCR和限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDA.结果 PCR、酶切、DNA测序鉴定证明成功构建了pcDNA3.1(+)-EDA真核表达载体,DNA测序显示重组质粒含有与EDA片段基因序列完全相等的基因.结论 成功构建了纤维粘连蛋白(fibronectin,Fn)基因的EDA外显子的真核表达载体pcDNA3.1(+)-EDA.
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骨形成蛋白-2基因克隆及真核表达重组子的构建
目的 探讨人骨形成蛋白-2(BMP-2)全长基因的克隆,及其真核表达重组子构建方法.方法 采用Trizol法从人髁状突骨组织中提取制备总RNA,利用逆转录技术转录出BMP-2 cDNA,以其为模版,PCR扩增出BMP-2全长基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2,经酶切和序列分析鉴定重组子的构建情况.结果 PCR扩增产物在1 200 000处有扩增条带,与目的 基因大小相符,重组质粒经限制性内切酶HindⅢ和XbaⅠ双酶切后,得到5 400 000和1 200 000的 BMP-2条带,BMP-2基因已成功克隆且成功与pcDNA3.1(+)连接.结论 成功克隆出人BMP-2基因,并构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2,为进一步研究BMP-2的功能、BMP-2基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础.
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人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达
目的构建人中性粒细胞多肽1(HNP1)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础.方法从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNP1基因cDNA片段,将纯化PCR产物与 pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO中.用脂质体转染COS-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达.结果从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO/HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础.
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人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定
目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.
