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hCGβ-C3d3融合蛋白在乳酸杆菌的表达及鉴定
目的 探讨融合基因人绒毛膜促性腺激素(hCG)β-C3d3在干酪乳酸杆菌有效表达,为研究携hCGβ-C3d3融合基因的乳酸杆菌直接黏膜免疫奠定基础.方法 用分子生物学技术构建质粒pIlac.hCGβ-C3d3,电穿孔转化干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)CECT 5276,挑选转化后的耐药菌落,在含红霉素的MRS培养基中培养,0.5%乳糖诱导后,在不同时间取上清,化学发光法检测hCGβ,免疫细胞化学鉴定融合蛋白.结果 经测序证实目的基因构建正确.免疫化学发光测定显示,转化成功的重组干酪乳酸杆菌在乳糖的诱导下可分泌hCGβ.免疫细胞化学鉴定显示hCGβ与C3d3融合成功.结论 实现了重组乳酸杆菌Lb.hCGβ-C3d3分泌性表达融合蛋白hCGβ-C3d3.
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聚己内酯-b-丙交酯共聚物微球免疫避孕体系的研究
目的:初步探讨含β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)的可生物降解嵌段共聚物聚己内酯-b-丙交酯(PCL-b-DLLA)微球作为免疫避孕释放体系的可行性.方法:采用双乳溶剂挥发法(W1/O/W2),用共聚组成为40/60的PCL-b-DLLA嵌段共聚物制备含β-hCG的可生物降解微球,表征微球的粒径大小及分布、表面形态等性能,建立毛细管电泳测定微球中β-hCG含量的方法,初步考察聚合物微球在小鼠体内的免疫效果.结果:微球表面平整光滑,粒径呈正态均匀分布;平均粒径为6.45m,载药量为1.49%;微球在动物体内一次注射,不经强化即可在相当一段时间内产生相应抗体.结论:聚合物微球对β-hCG具有佐剂效应,该嵌段共聚物有望用作免疫避孕疫苗β-hCG的释放载体.
关键词： 聚己内酯-b-丙交酯 β-人绒毛膜促性腺激素 可生物降解微球 免疫避孕 -
免疫避孕用含模型蛋白的新型可生物降解聚酯微球的研究
目的:考察新型可生物降解聚酯材料聚(5-羟基三亚甲基碳酸酯-co-三亚甲基碳酸酯)P(HTMC-co-TMC)作为口服免疫避孕疫苗载体的可行性.方法:以BSA为模型蛋白,采用改进的复乳溶剂蒸发法制备含BSA的微球,表征微球的性能参数及其体外释放行为.结果:微球表面光滑,粒径均一,分布较窄,不同共聚组成聚合物的释放速率不同.结论:可通过调节新型可生物降解聚酯的共聚组成调节BSA的释放速率,该类新型可生物降解聚酯有望成为口服避孕疫苗的控制释放载体.
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小鼠附睾分泌蛋白Spink12的原核表达与纯化
目的 原核表达带有His标签的小鼠附睾蛋白Spink12,对表达产物进行鉴定和纯化,以研究Spink12的免疫避孕效果.方法 提取小鼠附睾组织总RNA,RT-PCR扩增不含信号肽的Spink12蛋白编码序列,以NdeⅠ和EcoR Ⅰ酶切后,将其连入原核表达载体pET28(a);经酶切和测序鉴定正确的重组质粒pET28(a)-Spink12,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞.融合蛋白经IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE电泳和Western blotting免疫印迹鉴定.用Ni-NTA在非变性条件下利用不同的咪唑梯度浓度纯化融合蛋白6×His-Spink12.结果 酶切和测序结果显示成功构建出原核表达载体pET28(a)-Spink12.重组质粒转化大肠埃希菌BL21并经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳显示表达出约9kD的融合蛋白6×His-Spink12,与理论分子量相符.融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的23.5 %.用抗His单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹鉴定,检测到同样大小的条带.经纯化获得较高纯度的融合蛋白6×His-Spink12,纯度达91.1%.结论 成功表达并纯化了融合蛋白6×His-Spink12,为进一步研究Spink12的免疫避孕效果奠定了基础.
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精子特异性透明质酸酶PH-20结构与功能
精子表面特异性透明质酸酶(PH-20)是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的单链膜蛋白,特异性分布于精子头部浆膜和顶体内膜,是一种多功能蛋白,在受精过程中具有重要作用.鉴于PH-20在精子表面的特异性分布及其在受精中的作用,PH-20作为免疫避孕候选疫苗对象一直受到关注.继续深入研究PH-20的结构与功能,将有助于全面揭示精卵结合的分子过程.
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乳杆菌介导的免疫避孕疫苗的研制现状
免疫避孕是一种生育期妇女节育的重要措施,研制免疫避孕疫苗是当前研究的热点领域之一.乳杆菌是一种新型的疫苗载体,本研究综述了乳杆菌介导的猪卵透明带3α抗原和人绒毛膜促性腺激素β疫苗的构建及其作用机制等方面的研制现状.
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免疫避孕发展前景
“免疫避孕”是避孕方法发展过程中的新里程,它利用疫苗诱导机体发生适应性免疫应答,造成机体暂时的不孕.与目前常用的避孕方法相比,免疫避孕有许多的优点,如:特异性高、避孕效果持久但可逆、价格相对便宜、没有内分泌或代谢方面的副反应、易于使用,并且不需要植入物或手术干预等.目前,免疫避孕根据其作用靶点分为三类:配子产生、配子功能以及配子结局[1].
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人精子膜抗原的制备及其在人精子抗体检测中的应用
精子表面的抗原与受精和胚胎的早期发育有密切关系,其中部分抗原能引起机体产生相应的抗体,从而影响到精子的受精功能和胚胎的发育,导致免疫性不育.因此对人类精子膜抗原的研究有助于从蛋白质水平来揭示受精的过程和不育的机制,为不育特别是免疫性不育的治疗及免疫避孕开辟一条新途径.因为精子膜比较坚固,难以破碎和溶解,不易得到较高浓度的精子膜抗原.而且即使精子膜被破碎溶解后,往往有许多种抗原成分混在一起,为了提取一种成分,常需反复分离.
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CpG ODN对ZP~(121-140)表位合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响
目的:探讨CpG ODN对透明带(四)抗原表位ZP~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应影响.方法:应用人工合成ZP2~(121-140)表位肽,与20μg CpG ODN或等量完全弗氏佐剂(CFA)混悬后左胫前肌免疫雌性BALB/c小鼠,初次免疫后2、4、6周各加强免疫一次,共免疫四次.在每次加强免疫前和末次免疫后两周断尾取血,分离血清,分析特异性lgG抗体及非特异性细胞因子IFN-γ、TNF-Ⅱ,IL-10水平;收集小鼠阴道冲洗液,离心取上清,分析特异性IgA抗体水平.免疫小鼠生育实验结束后,取卵巢组织行病理学分析.结果:CpG ODN组诱导的特异性IgG和IgA水平较CFA组有增高趋势,但无显著性差异(P＞O.05).CpG ODN组诱导的非特异性IFN-γ和TNF-水平明显高于CFA组(P＜0.05);而CpG ODN组诱导的IL-10水平显著低于CFA 组(P＜0.05).两种佐剂对小鼠的受孕率影响没有显著性差异,但CpG ODN组孕鼠每胎产仔数明显低于CFA组(P＜O.05).病理学分析显示实验小鼠卵巢组织无病理性变化.结论:CpG ODN对Zp~(121-140)合成肽诱导的免疫应答和免疫避孕效应略优于CFA,更适合用于避孕疫苗佐剂研究.
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HER-2/neu胞外区基因疫苗的免疫避孕作用
目的:研究HER-2/neu胞外区基因疫苗在免疫避孕中的作用.方法:构建含人HER-2/neu胞外区的重组质粒pcDNA3-hECD,以该质粒转染真核细胞C2C12或注射小鼠股四头肌,检测其在体内外表达情况;以该质粒基因免疫雌性BALB/C小鼠,部分小鼠于第12周以重组蛋白hECDu加强免疫,以ELISA方法检测抗HER-2/neu抗体应答,3H-TdR掺入法检测细胞免疫应答,并观察其诱导免疫避孕的情况.结果:C2C12转染上清及小鼠股四头肌注射局部均可检测到hECD蛋白的表达.小鼠经基因免疫后可产生较高水平抗体应答,抗体水平至少维持28周,同时可检测到较高水平细胞免疫应答(pcDNA3-hECD与对照组SI值分别为9.55和1.25);基因免疫后小鼠平均产仔数(3.8±2.9,对照组为9.7±1.6)明显降低,以蛋白加强免疫后产生特异性回忆反应,平均产仔数进一步降低(2.0±1.7).而且,免疫小鼠产后4天子宫及卵巢与正常产后鼠相比均无明显区别.结论:基于HER-2/neu胞外区的基因疫苗免疫小鼠可诱导有效的免疫应答并产生一定免疫避孕效果,并且这种避孕作用经特异性蛋白加强免疫可进一步得以提高.
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避孕疫苗研究进展
免疫避孕疫苗被认为是很有前景的避孕方式.目前开发避孕疫苗主要针对配子产生,配子功能和配子生长三个环节.针对配子产生的避孕疫苗有不同程度的效果,但可能影响性激素水平进而影响性功能;针对配子功能的疫苗中,抗精子疫苗研究的重点在于找出适合的精子特异性表位,并增强其免疫原性及免疫效果;抗-ZP疫苗的避孕效果较好,但可导致卵巢炎,研究关键是要区分出不孕相关的表位和导致卵巢炎的表位以终避免副作用的发生.HCG疫苗的研究集中在增加免疫原性和控制生育的有效性.
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前列腺癌相关肿瘤标志物的研究进展
前列腺癌与其他恶性肿瘤一样,应争取早防、早诊、早治.寻求肿瘤标志物是目前肿瘤早期诊断常用的方法.本文就前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)和新发现的几种相关肿瘤标志物综述如下.1PSAPSA是目前临床上广泛应用的检测指标,它是20世纪60年代末在研究免疫避孕过程中发现的.PSA是前列腺腺泡和导管上皮细胞分泌的一种分子量约34 000的单链糖蛋白,是精液的主要成分之一.其具有糜蛋白活性,能水解精液凝固蛋白,使精液液化.PSA蛋白只在前列腺组织中存在,在前列腺癌患者血清中也有不同程度升高.1986年美国食品及药品管理局推荐将血清PSA检测用于前列腺癌的诊断.
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不育患者血清精子蛋白17抗体的检测及临床意义
目的:检测抗精子抗体(AsAb)阳性不育患者血清中抗精子蛋白17(Sp17)的抗体,探讨该抗体住免疫性不育血清学诊断和免疫避孕方面的潜在应用价值.方法:用重组人Sp17作为抗原,ELISA法检测62例AsAb阳性血清中Sp17抗体阳性率及滴度,分析AsAb中抗Sp17的含量.结果:AsAb阳性血清中Sp17抗体阳性率为56.5%,男女之间差异无显著性.Sp17抗体占AsAb的(10.09±7.45)%,结果具有统计学意义(P＜0.05).结论:Sp17是重要的精子抗原组分,血清中Sp17抗体的检测可作为不育患者辅助诊断指标,同时也提示Sp17可能是一种免疫避孕候选抗原疫苗.
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男性免疫避孕的研究进展
男性免疫避孕的理想目标是研制出一种安全、有效、可逆、使用方便、易于接受的避孕疫苗.目前的研究主要是从生殖激素和精子功能蛋白中筛选为合适的靶抗原用于免疫避孕疫苗的开发.以生殖激素作为靶抗原的避孕疫苗由于其不同程度的不良反应和操作的繁琐性,并没有得到广泛推广.近年来的研究表明,以精子特异性抗原为靶抗原开发男性免疫避孕疫苗具有现实性和可行性.然而,该免疫避孕疫苗的开发也面临着很多挑战,如何筛选合适的靶抗原、提高疫苗的免疫原性、合适的免疫方式、降低疫苗的不良反应及成本等都是要解决的重要问题.
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附睾蛋白酶抑制蛋白的研究进展
附睾蛋白酶抑制蛋白(Eppin)基因是近克隆到的一种人类和小鼠附睾和睾丸中特异性表达的基因.Eppin蛋白是一种富含半胱氨酸同时含有乳清酸蛋白(WAP)和牛胰蛋白酶抑制蛋白(BPTI)结构域的分泌蛋白,它与精子成熟和生殖有关,此外还参与了人类附睾的天然免疫系统.针对Eppin蛋白的免疫避孕是一种有效和安全的方式,但还需进一步验证它的安全性.本文就Eppin的生殖和免疫功能及在免疫避孕中的应用进行综述.
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精子蛋白17的研究进展
精子蛋白 17(Sp17)为一种睾丸组织特异性蛋白,参与精子的顶体反应.然而,近年来发现Sp17在正常非睾丸组织和肿瘤组织也有表达.它作为一种免疫避孕的候选抗原以及肿瘤免疫治疗的理想靶分子倍受关注.本文就Sp17的特性、表达与分布、生理学功能及临床研究的新进展进行了综述.
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精子抗原受精素β的研究进展
受精素β是精子表面特异性抗原,主要通过其去整合素结构域在受精过程中发挥重要的生理功能.本文对受精素β的蛋白质结构、定位及在受精过程中的作用进行了综述,并提出受精素β可作为免疫避孕疫苗研究中重要的靶分子,具有突出的应用前景.
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NIH3T3细胞及小鼠骨骼肌中人PH-20基因疫苗的表达
目的:研究人PH-20基因疫苗在体内外的表达.方法:以脂质体介导基因转染法将pcDNA3.1(+)-hPH-20基因疫苗导入MH3T3细胞中,RT-PCR和原位杂交检测hPH-20 mRNA的表达.以脂质体介导基因转染法将疫苗接种于BALB/C小鼠后腿股内侧肌,分别于接种后第4、7、11、16天取小鼠股内侧肌进行RT-PCR检测.结果:体外转染的NIH3T3细胞阳性克隆经RT-PCR检测,可见1530 bp目的条带;原位杂交结果显示阳性细胞胞浆中可见蓝紫色颗粒.取注射基因疫苗后的小鼠注射部位肌肉以RT-PCR法检测到1 530 bp的目的条带,空载体及生理盐水对照组未见目的条带.结论:人PH-20基因疫苗体内外均可表达.
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男性免疫性避孕疫苗的应用研究
近年来男性免疫性避孕控制生育的研究日益增多.男性免疫避孕的理想目标是在不影响性激素水平、性欲和性功能的基础上研制出一种高效、安全、可逆的避孕疫苗,其基本原理是通过外源性靶抗原抗体中和体内生殖激素的作用,抑制精子发生,进而避孕.研究方法主要从生殖激素(GnRH、FSH、LH及其相应受体)和精子中筛选为合适的靶抗原用于免疫避孕疫苗的研究,睾酮激素下降明显、抗体滴度小、精子不可逆抑制是目前存在的常见问题.当今选择特异结合靶点抗原以及精子相关靶抗原进行免疫性避孕的方法有效促进了男性避孕疫苗的开发,是有前景的研究重点之一.
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人精子顶体膜相关蛋白SAMP32 DNA避孕疫苗的构建
目的 探讨构建hSAMP32 DNA疫苗的方法.方法 根据Genbank hSAMP32 cDNA序列设计引物,RT-PCR得到hSAMP32 DNA,将其亚克隆至pGEM-T载体,酶切鉴定后测序;再构建pcDNA3.1(+)-hSAMP32质粒,并对质粒DNA定量.结果 (1)人睾丸组织中提取的总RNA显示2条清晰条带,分别对应28S、18S;RT-PCR扩增产物与预期的目的基因hSAMP32长度一致;(2)RT-PCR产物与载体pGEM-T连接后测序,显示其与Genbank的hSAMP32基因序列一致;(3)超螺旋的pcDNA3.1(+)-hSAMP32 DNA疫苗不含内毒素.结论 应用亚克隆技术构建hSAMP32 DNA避孕疫苗的载体pcDNA3.1(+)-hSAMP32,为研制避孕疫苗奠定实验基础.
