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耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的临床应用
目的 分析耐多药结核病临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的临床价值方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分析了同时25株耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和20株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变结果以结核分支杆菌(H37RV)为对照,20株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为96.4%.45株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:25株多耐药临床分离株中,23株rPOB基因图谱异常;15株KatG基因图谱异常;19株rpsL基因图谱异常.其敏感性分别为rPOB(92%)、KatG(60%),rpsL(76%)结论结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致.
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山东省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究
目的分析山东省利福平耐药结核菌株rpoB基因突变特点.方法本研究为回顾性调查,135株样本分别取自1997、2000及2003年的流行病学调查和医院的临床样本.采用PCR直接基因测序法分析rpoB基因突变.结果 135株结核菌中, 60株为利福平耐药菌株,其中 55株(91.7%)rpoB基因的利福平耐药决定区(RRDR)有突变.突变频率依次为密码子531(60.0%),526(29.1%)和516 (7.3%).1株耐药菌同时发生了少见的3个密码子(511,515,518)的多核苷酸突变.75株敏感菌株中, 仅3株(4.0%)有突变,均发生在密码子533,包括一个新发现的突变基因型CTG(Leu)→ATG(Met).结论来自山东省结核菌中,利福平耐药表型与rpoB基因突变的符合率为94.1%,并提示密码子533突变与利福平耐药表型相关性较低.
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PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究
目的应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药性的意义.方法以结核分枝杆菌H37Rv为对照、50例耐RFP(单耐和多耐)结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本,采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变.结果 50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP 28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%.结论 PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法.
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结核分枝杆菌rpoB基因突变特征的初步探讨
目的 了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征.方法 对65株临床分离菌株rpoB基因509-631位点分别进行PCR-SSCP检测和DNA序列测定,观察不同耐药株rpoB基因突变的规律.结果 耐利福平分离株96.4%(27/28)存在rpoB基因突变,其中526位突变率64.3%(18/28),513位突变率21.4%(6/28),531位突变率7.1%(2/28),529位突变率3.6%(1/28);耐其他抗结核药18.5%(5/27)存在rpoB基因突变,突变位点具有随机性.所有敏感菌株均无突变.结论 rpoB基因突变与利福平耐药密切相关,浙江省rpoB基因突变主要以526位突变为主,其次为513位,两者占总数的86%(24/28),而耐其他抗结核药菌株也存在rpoB基因的突变,但没有明显规律,且均对利福平敏感.
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海产品中溶藻弧菌的分离及多种方法鉴定效果的比较
目的 了解北京市市售海产品中溶藻弧菌的污染情况,并对使用不同方法鉴定溶藻弧菌的效果进行比较.方法 样品经碱性蛋白胨水增菌后,分别于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂培养基和科玛嘉狐菌显色培养基上划线培养,实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法鉴定可疑菌落.以rpoB基因测序方法为参考,比较了实时荧光PCR和VITEK两种方法的鉴定效果.结果 对北京市水产品市场随机采集的116份海产品进行了检测,实时荧光PCR法鉴定出溶藻弧菌阳性样品95份,检出率高达82％.使用科玛嘉弧菌显色培养基的检出率高于TCBS培养基,分别为82％ (95/116)和72％ (83/116).经rpoB基因核苷酸序列测定确定95株疑似菌株为溶藻弧菌.采用VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对这95株菌株进行鉴定,31株鉴定为溶藻弧菌,其余未能得到准确的鉴定结果.结论 北京市市售海产品中溶藻弧菌检出率高.科玛嘉弧菌显色培养基比TCBS琼脂培养基更适于溶藻弧菌的分离,实时荧光PCR法的鉴定效果优于VITEK法.
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结核分支杆菌耐利福平耐药基因的检测
目的评估应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用PCR-SSCP方法对93株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株35株,耐RFP或含耐RFP耐多药株58株)和33例耐RFP肺结核病人痰标本rPOB基因突变进行检测,并对部分常规药敏试验耐药而用PCR-SSCP未检测到rPOB基因突变的PCR扩增产物阴性菌株用双脱氧末端终止法进行测序分析.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,35株药物敏感株的rPOB基因PCR扩增产物258bp片段SSCP图谱正常;58株耐RFP分离株中,52株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为89.7%.SSCP图谱正常的5株耐RFP的PCR产物经测序证实,4株在531位密码子TCG→TTG,1株在526密码子CAC→TAC,1株未改变.33例耐RFP肺结核病人痰标本有30例PCR扩增阳性,23例SSCP图谱与H37RV株有差异,rPOB突变率为76.7%.结论 PCR-SSCP技术可以快速、准确地检测结核分支杆菌rPOB基因突变,该技术有望直接用于临床标本耐药性检测.
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焦磷酸测序技术在利福平rpoB基因突变检测中的应用评价
目的 应用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用价值.方法 利用焦磷酸测序技术,测定150株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因81个碱基的利福平抗药性决定区(RRDR),分析rpoB基因突变特点,并与绝对浓度法和MIC法药敏结果进行比较.结果 150株结核分枝杆菌中66株耐药84株敏感,54株为耐多药菌株,rpoB基因突变涉及6个密码子12种突变基因型,常见的突变位点及突变形式分别为531位TCG突变为TYG,占60.6%,526位CAC突变为TAC、GAC,占22.7%.耐药性检测结果表明,焦磷酸检测法与绝对浓度法二者的符合率为92.7%,与MIC法的符合率为97.8%.结论 焦磷酸测序检测技术不仅是一种快速、准确、高通量的利福平分子药敏检测方法,同时也是结核分枝杆菌耐药性研究的有用工具.
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应用反向线性杂交技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究
探讨反向线性杂交技术(reverse line blot assay,RLB)在结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药性快速检测中的应用价值.采用RLB将包含rpoB基因核心区的扩增产物与标记特异性探针的膜进行杂交,共对121株结核分枝杆菌进行RFP耐药性检测,并将结果与常规药敏实验进行比较.结果发现,121株中有71株对RFP耐药,56株为多重耐药株;采用RLB共检测到65株RFP耐药株rpoB基因核心区存在突变,其灵敏度为91.5%(65/71);50株RFP敏感株中均未检测到突变,则特异性为100%(51/51);56株多耐药菌株中,92.9%(52/56)存在rpoB基因核心区突变.因此,用RLB检测结核分枝杆菌RFP耐药株具有快速,高效,特异性和灵敏度高的优点,且可用于多耐药菌株的筛选,具有推广和潜在的临床应用价值.
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结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变的序列分析
目的 探讨结核分枝杆菌耐药基因rpoB突变与利福平耐药性的关系.方法 采集81例临床标本,分离结核分枝杆菌菌株,PCR扩增rpoB基因及测序,并与利福平药物敏感试验结果比较.结果 27例耐利福平菌株中,20株发生rpoB基因突变(74.1%),突变位点包括531和526在内的7个位点10种突变类型,并发现新的突变位点和突变形式;54株敏感株中,1株发生突变(1.9%).结论 利福平耐药rpoB基因突变有一定区域性,为发展快速的基因诊断技术检测耐多药结核病奠定了基础.
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结核分枝杆菌临床分离株利福平耐药表型及rpoB基因型分析
目的 分析结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株利福平(rifampin,RFP)耐药表型及rpoB基因突变关系,阐明MTB RFP耐药株rpoB基因突变特征.方法 采用改良罗氏培养基比例法检测387株MTB临床分离株对RFP敏感性,并进行rpoB基因测序.对经测序rpoB基因511位和533位密码子突变株进行RFP小抑菌浓度(MIC)检测.结果 比例法检测387株 MTB 临床分离株中,198株RFP耐药株,189株RFP敏感株.rpoB基因测序结果表明,198株比例法RFP耐药株中,192株(96.97%)发生rpoB基因突变,涉及16种单位点和24种双位点密码子联合突变类型,单位点和双位点密码子联合突变率分别为84.34%(167/198)和12.63%(25/198),其中发现1种单位点和21种双位点密码子联合突变新类型.常见的突变位点为531位(51.01%)、526位(21.21%)和516位(7.07%)密码子.6株(3.03%)耐药株在rpoB测序范围内未见突变.189株比例法RFP敏感株中,174株(92.06%)在rpoB基因测序范围内未见突变,15株(7.94%)发生突变,其中7株CTG511CCG(Leu→Pro)突变和6株CTG533CCG(Leu→Pro)突变.511位和533位密码子突变株MIC检测结果提示其突变与低度耐RFP相关.结论 所得数据及一些新的发现为进一步研究MTB RFP耐药机制、研制快速新型分子药敏试验方法提供理论和实际应用依据.
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焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究
目的 利用焦磷酸测序技术,建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法.方法 应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段,经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板,设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81 bp序列突变情况,与H37Rv序列比对后判断耐药结果.结果 通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台,32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变,22株利福平敏感株未检测到突变,检测结果与直接测序符合率达100%.结论 本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变.
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用DNA 芯片快速检测结核分支杆菌对利福平的耐药性
目的研制一种新型DNA芯片,用于结核分支杆菌对利福平的耐药性快速检测.方法根据结核分支杆菌rpoB基因的序列信息设计探针并制作DNA芯片,PCR扩增并荧光标记包含结核分支杆菌rpoB基因突变热点的目的片段,与芯片杂交,同时以DNA测序法为对照.结果17株随机抽取的耐利福平结核分支杆菌菌株有14株可用DNA芯片检测出来,效率可达83%;患者痰液中少量的DNA足够进行芯片检测,无须进行培养.结论用DNA芯片来检测结核分支杆菌对利福平的耐药性具有较高的特异性和灵敏度,该法快速、精确,可以应用于临床耐药性检测.
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浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变研究
目的 了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征.方法 利用传统药敏检测法和以PCR为基础的DNA测序对从浙江省立同德医院和浙江省中西医结合医院的188例结核病患者中分离的188株结核分枝杆菌进行耐药分析和rpoB基因突变分析,观察结核分枝杆菌利福平耐药决定区基因突变情况与临床耐药的关系.结果 188株临床分离株中有57株为耐药株(30.3％),其中单耐利福平18株(9.6％),单耐其他抗结核药物28株(14.9％)(异烟肼10株、链霉素12株和乙胺丁醇6株)；耐2种或2种以上药物(包括异烟肼、链霉素和乙胺丁醇)的多耐药临床分离株11株(5.9％).29株耐利福平菌株中,27株(93.1％)存在rpoB基因突变,其中526位突变率为55.6％ (16/27),513位突变率为22.2％(5/27),531位突变率为14.8％ (4/27),529位突变率为7.4％ (2/27)；28株耐其他抗结核药物分离株中,4株(14.3％)存在rpoB基因突变,突变位点分别位于526位(2株)和513位(2株).其余131株敏感菌株rpoB基因均无突变发生.结论 浙江省耐利福平结核分枝杆菌与rpoB基因突变有关,主要以526位与513位突变为主.
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应用PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型
目的 评价PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型的临床应用价值.方法 应用PCR-荧光探针法对142份涂阳痰液样本进行分子菌种鉴定,对鉴定为结核分枝杆菌复合群的标本进行katG、inhA、rpoB 耐药基因突变位点检测,并与传统药敏试验结果比较.结果 142份涂阳痰样本中3份鉴定为非结核分枝杆菌,139份鉴定为结核分枝杆菌复合群;139株结核分枝杆菌中92株未检测出katG、inhA、rpoB基因耐药检测位点突变,其中传统药敏结果72株为HSRS、6株为HSRR、14株为HRRR; 33株检测出katG和rpoB或inhA和rpoB两个基因耐药位点突变,传统药敏结果均为HRRR;11株检测出katG或inhA耐药基因位点突变,传统药敏结果均为HRRS;1株检测出rpoB耐药基因位点突变,传统药敏结果为HSRR,药敏试验符合率为84.17％;对部分样本行PCR产物直接测序(PCR-DS),结果显示,PCR-荧光探针和PCR-DS检测耐多药结核分枝杆菌基因型结果符合率为100.00％.结论 PCR-荧光探针法快速检测耐多药结核分枝杆菌基因型简便、快速,具有临床推广应用价值.
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TaqMan MGB双探针实时PCR快速检测结核分枝杆菌rpoB基因多位点突变方法的建立
目的 建立快速、灵敏的检测结核分枝杆菌rpoB基因常见突变位点的新方法.方法 采用TaqMan小沟结合物(MGB)探针技术,检测146例活动性肺结核患者和35例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况,测序方法为参考方法.结果 146例活动性肺结核患者痰标本中,双探针方法检出阳性118例,其中rpoB基因突变56例,与测序方法比较符合率100.0%;35例非结核性肺部疾病患者痰标本双探针方法检测均为阴性,特异性100.0%;该方法低检出下限为1×10~3拷贝/ml.结论 TaqMan MGB双探针方法能快速、准确地检测结核分枝杆菌rpoB基因位点突变情况,适用于临床对耐药结核分枝杆菌的快速诊断.
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结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特征研究
目的：了解郑州市结核分枝杆菌耐利福平临床分离株的相关耐药rpoB基因突变特征。方法应用PCR方法对40株结核分枝杆菌利福平耐药、40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株中包含“利福平耐药决定区（RRDR）”在内的rpoB基因片段（385bp）进行扩增，并将扩增产物进行测序，以H37Rv结核分枝杆菌标准株的DNA序列作为参比序列，分析结核分枝杆菌临床分离株的突变特征。结果40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株均未检测到突变，结核分枝杆菌耐利福平临床分离株中有36株检测到突变，突变率92．3％，且突变均位于RRDR区域内；突变位点为8个，共有8个突变类型；常见的突变热点依次为531位点，该位点突变率为64．1％；526位点，其突变率为12．8％和516位点，其突变率为10．3％。结论rpoB基因是郑州市结核分枝杆菌对利福平耐药的相关基因，其中在RRDR内的531位点基因突变率高，并可通过对rpoB基因的突变检测，对耐多药结核病进行预测。
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利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变
目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片.方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较.结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养.结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断.
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淮南矿区煤工尘肺结核患者耐多药结核分枝杆菌耐药基因rpoB序列分析
目的 分析淮南矿区尘肺结核患者感染的耐多药结核分枝杆菌(multiple drugs resistant bacillus tuberculosis,MDR-TB)利福平耐药基因rpoB突变特点.方法 收集结核分枝杆菌临床分离株114株,采用药敏试验鉴定MDR-TB,抽提MDR-TB DNA和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增rpoB基因,并应用全自动DNA测序仪对rpoB基因的突变集中区域进行测序分析.结果 从114株结核分枝杆菌临床分离株中检出MDR-TB31株(27.19％,31/114),31株MDR-TB中rpoB基因突变率为93.55％(29/31),主要集中在531(45.16％,14/31)和526位点(29.03％,9/31)碱基置换突变,其次是516(3.23％,1/31)、535位点(3.23％,1/31);1株526位和531位同时突变,1株511位和526位同时突变,2株未发现rpoB基因突变.随机检测的10株利福平敏感株未见rpoB基因单链构象异常.结论 高度保守的rpoB基因突变是导致尘肺结核患者MDR-TB利福平耐药的分子基础,其突变位点呈多样性.
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耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究
目的建立快速检测耐多药结核分枝杆菌的分子药敏方法,掌握盐城、南通地区结核分枝杆菌KatG及rpoB基因的突变特点,了解耐药分子机制及探索痰标本结核分枝杆菌耐INH、RFP直接检测的可行性.方法对收集的47例耐INH、RFP的结核分枝杆菌临床痰分离株行PCR-自动测序法检测KatG及rpoB基因突变,以结核分枝杆菌标准株H37Rv为参比菌株,应用BACTEC460TB快速培养系统进行自动培养、药敏.结果47例耐INH、RFP分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29/47、39/47,两者同时突变率为47%.结论PCR-直接测序法敏感、特异,是可靠快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变,适合于临床肺结核患者MDR-TB痰标本耐药性的快速检测.
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耐多药结核分枝杆菌三种基因的快速检测
目的:探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系.方法:采用PCR和PCR-DS技术对57 例耐多药结核临床分离株进行katG、rpoB和emb B基因检测和序列分析.结果:耐INH(katG)、RFP(rpoB)、EMB(embB)基因突变率分别为63.8 %、90.7%、37.1%,其中同时耐INH(katG)和RFP(rpoB)基因突变率为54.1%,同时耐三种药的基因突变率为65.6%.结论:PCR-DS法对耐两种或两种以上药物的结核检出率较高, 与传统药敏试验互相弥补,对临床用药有指导意义.
