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生物人工肝细胞材料研究进展
肝细胞是生物人工肝(bioartificial liver,BAL)中的核心生物成分,其研究颇受国内外学者的重视.猪肝细胞具有类似人肝细胞的高代谢功能,在BAL中可作为人肝细胞的替代品.重组具有氨清除等功效的人肝细胞系在BAL中取得了较好成效,具有一定的应用前景.为了探索一种永生化的、无致瘤性的、有分化功能的人肝细胞系,作为BAL生物成分的理想细胞来源,国外学者研究设计了一种可回复性永生化程序,为解决细胞材料问题提供了新的思路和手段.肝非实质细胞及某些种类细胞,对维持肝细胞的三维结构的生存环境,改善肝细胞的代谢活性和存活起重要作用,与肝细胞混合培养后明显促进肝细胞的增生和分化,其在BAL系统中的潜在价值已逐渐引起注意.然而,肝细胞的增生、长期培养、功能维持及人源肝细胞的严重短缺等都是亟待解决的问题.
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肝纤维化的发病机制及治疗进展
肝纤维化是肝脏内细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)弥漫性过度沉积性疾病，无假小叶形成，其发生机制主要是肝内ECM合成与降解失衡，表现为ECM大量沉积。肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的中间环节，肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell，HsC)在此过程中起关键性作用。HSC激活并转化为肌成纤维样细胞(Myofibroblastic-like cell， MFLC)和成纤维细胞fibroblastic cell，FC)，是肝纤维化发生、发展的核心环节，肝损伤是引发肝纤维化的始动环节。肝细胞和其他肝非实质细胞旁分泌释放一些细胞因子激活HSC，活化的HSC增生，合成细胞外基质；同时表达部分细胞因子(自分泌)，共同参与调控过程。与基质降解有关的金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)、金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPS)、α2-巨球蛋白也相应发生变化，后导致ECM过度沉积，形成纤维化。……
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肝移植急性排斥反应的细胞及分子免疫学研究进展
目前,肝移植已经成为治疗各种终末期肝病的有效措施,而急性排斥反应(AR)则是肝移植术后常见的并发症之一,其组织病理学表现主要是:汇管区混合炎症细胞浸润、胆管炎和血管内皮炎.肝移植后AR是一种以细胞免疫为主、体液免疫为辅的特异性免疫反应,但肝脏由于其自身解剖和生理学因素以及一些非实质细胞的影响,使其在发生AR时具有与其他移植器官不同的特点.在肝移植AR过程中,众多的肝非实质细胞通过各种分子机制发挥着各自不同的功能,现分述如下:
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大鼠肝癌细胞照射后非实质细胞影响肝癌细胞基因的变化
目的 探讨照射后微环境对残存的肝癌细胞转移能力影响及分子机制.方法 分离大鼠肝脏非实质细胞(NPCs),贴壁后进行照射,然后收集培养上清液与照射过的大鼠肝癌细胞McA-RH7777-6 Gy共培养.经不同培液上清共培养McA-RH7777-6 Gy细胞得到RH 6 Gy(与未照射NPCs上清液共培养)和RH 6 Gy-R(与照射后NPCs上清液共培养)细胞株.采用基因芯片技术检测RH 6 Gy和RH 6 Gy-R细胞中基因的表达.通过生物信息学对显著变化的基因进行分析,并利用DAVID数据库对这些变化的基因进行功能富集分析(GO-analysis)和信号转导通路富集分析(KEGG-analysis,BIOCARTA-analysis).进行细胞划痕实验,比较RH6Gy细胞和RH 6 Gy-R细胞的运动迁移能力.结果 基因芯片检测结果显示,RH 6 Gy-R与RH 6 Gy细胞比较,周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、丝裂原活化蛋白激酶9(MAPK9)、细胞周期蛋白(Cyclin)A、Toll/白细胞介素-1受体相关蛋白(TIRAP)、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1/2(PDK1/2)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)等15个肿瘤发生发展相关基因的表达都显著高于未照射上清共培养组,且这些表达差异显著的基因多数富集在肿瘤转移相关通路,如腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、Ras信号转导通路等.体外划痕实验显示,细胞划痕培养48 h后,RH 6 Gy细胞面积愈合率为(9.00±1.35)％,RH 6 Gy-R细胞面积愈合率为(41.30 ±6.32)％.结论 经照射后的残存的肝癌表现出更强的转移能力,可能与其微环境中的NPCs相关,我们推测照射后的NPCs释放的某些细胞因子促进了肝癌残存细胞转移相关mRNA的表达,从而激活相关癌转移通路.
关键词： 肝非实质细胞 肝癌细胞 转移 功能富集分析 信号转导通路富集分析 -
杆树突状细胞的分离培养
树突状细胞(DC)是一类专职性抗原呈递细胞,不仅启动免疫反应和诱导免疫耐受,还在调节免疫反应与免疫耐受的平衡中起决定性作用.肝脏因其固有的移植耐受性而在免疫耐受研究中深受关注,肝移植物容易存活,伴有肝移植的其他器官(如心脏、肾脏等)移植存活时间也较其单独移植明显延长.近有人提出,在肝移植耐受中DC可能起关键作用,但因其难于分离培养,国外仅美国Pit tshburgh大学在做相关研究,国内尚未见报道.材料与方法:1.肝非实质细胞的分离:取6～8w小鼠,麻醉后无菌开腹,门静脉插管,用前灌液(PBS+肝素500μ/10 0ml)灌流2～3min,改用注射器缓慢推注2ml Ⅳ胶原酶(GIBCOL公司,0 .05%);取材后剪碎,15ml Ⅳ胶原酶液(0.05%)体外消化30min.尼龙网过滤,PBS液清洗(400g×5min离心)两次,稀释成4～5ml细胞悬液. 下铺细胞分离液Percoll(Pharmacia公司)制成的不连续密度梯度液,5 00g×30min离心后,细胞分三层,先吸弃上层细胞碎片,再吸取两液体界面的肝非实质细胞,避免吸到底层的血细胞,RPMI 1640液(GIBCOL公司)清洗两次,400g×5min离心,即可得肝非实质细胞.2.肝树突状细胞(HDC)的培养:将肝非实质细胞用含灭活的10%胎牛血清(GIBCOL公司)的RPMI 1640完全培养液调整细胞浓度为2.5×106/ml,接种于24孔培养板,每孔1ml,加G M-CSF(GIBCOL公司)10ng/ml.培养第三天轻轻吸去未贴壁细胞,换液 .后隔天半量换液,培养第7～8d可收取HDC.结果与讨论每只小鼠可得肝非实质细胞约1.0～1.5×107个,细胞大小不一,类型较多.培养24～48hr后,有大量细胞贴壁生长,少量HDC前体细胞半贴壁状散在分布,经筛选、扩增,第4d时HDC数量增多,出现6～8个细胞组成的小集落.第7～8d,HD C数量增多,此阶段细胞有一明显的增殖高峰,有大量半贴壁半悬浮的集落,集落表面的细胞有小的突起.第7～8d,每只小鼠HDC得率约为2～3×106个.因HDC难于分离培养,使HDC的研究受到限制.我实验室在查阅文献的基础上,经过摸索,终于能在普通实验条件下分离培养HDC,为进一步进行HDC相关研究提供技术基础 .
