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人宫颈癌基因RNA干扰真核表达载体的构建及其稳定转染胰腺癌细胞株的建立
目的:构建针对人宫颈癌基因2(HCCR2)有效靶点的RNA干扰真核表达载体,鉴定获得干扰质粒稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.方法:设计并合成多个针对HCCR2基因的RNA干扰序列,并将其插入真核表达慢病毒载体pGCsi-H1/Hygro/NEGative,通过测序和与HCCR过表达载体共转染293T细胞后行Western blot检测,筛选出有效干扰质粒;通过脂质体转染法将该有效干扰质粒pGCsi-HCCR2稳定转染至人胰腺癌细胞株PANC1.抗生素G418筛选获得稳转细胞株;Westernblo凇测稳转细胞株中HCCR2蛋白表达水平.结果:HCCR2干扰载体和过表达栽体共转染293T细胞后Western blot检测结果表明干扰质粒3具有佳干扰效果,选其作为终干扰质粒.将该质粒稳定转染至胰腺癌PANC1细胞后,Western blot检测显示,干扰组的PANC1细胞株与空载体组比较,HCCR2蛋白表达水平下调,表明获得HCCR2的RNA干扰质粒稳定转染的PANC1细胞株.结论:成功构建了HCCR2的RNA干扰真核表达载体及其稳定转染的人胰腺癌PANC1细胞株.
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人宫颈癌基因蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
目的:制备人宫颈癌基因蛋白单克隆抗体并初步用于肝癌血清检测.方法:重组表达HCCR-1蛋白胞外区(第167th-360th氨基酸)进行动物免疫,用含有HCCR蛋白抗原表位的融合蛋白筛选阳性克隆.通过ELISA、Western Blot、免疫组化鉴定抗体性质,并用于肝癌血清样本检测.结果:获得3株抗人HCCR蛋白单克隆抗体,其中B3抗体特异性、灵敏度较好.ELISA结果表明B3只识别GST-HCCRep蛋白和His-HCCR蛋白,与其他蛋白没有交叉反应;B3可检测到10 mg/L的GST-HCCRep蛋白;B3抗体亲和力常数Kaff=1.86× 107(L/mol);Western Blot结果表明该抗体可识别天然HCCR蛋白;免疫组化检测表明肝癌组织中有HC-CR蛋白表达而正常组织中未见表达;肝癌患者血清HCCR阳性率达到75％.结论:成功制备了HCCR单克隆抗体,为建立新的肝癌早期诊断方法奠定了基础.
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人宫颈癌基因在消化系肿瘤中的表达及其临床意义
背景:人官颈癌基因(HCCR)是在宫颈癌中发现的一个新的癌基因,可能通过负向调节p53而促进肿瘤发生.目的:检测HCCR在人胃癌、结肠癌、肝癌中的表达,探讨其与肿瘤临床病理特征的关系.方法:以免疫共沉淀法检测HCCR在消化系肿瘤患者外周血中的表达,以细胞免疫荧光和免疫细胞化学染色检测HCCR在消化系肿瘤细胞株中的定位和表达,以免疫组化方法检测HCCR在肿瘤组织中的表达,并分析其与肿瘤临床病理特征的关系.结果:HCCR在消化系肿瘤患者外周血中有表达,肿瘤细胞株中其表达定位于细胞膜和细胞质.HCCR在人胃癌、结肠癌、肝癌组织中的阳性表达率显著高于相应正常或癌旁组织(P＜0.05).HCCR的阳性表达率与胃癌部位和肝癌组织学分级显著相关(P＜0.05),与其他肿瘤临床病理特征均不相关.结论:HCCR在人消化系肿瘤细胞和组织中表达较强,可能与肿瘤的发生、发展有关,有望成为消化系肿瘤诊断的标记物.
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缺氧对人肝癌细胞株SMMC7721中HCCR表达的影响及其调控机制
缺氧是实体瘤微环境的基本特征之一.人宫颈癌基因(HCCR)是新近发现的一种癌基因,在多种人类肿瘤中过表达.然而,尚缺乏HCCR在肿瘤缺氧环境中的表达及其调控机制的研究.目的:探讨缺氧对人肝癌细胞株SMMC7721中HCCR表达的影响及其调控机制.方法:SMMC7721细胞分别接受缺氧培养以及LY294002(PI3K特异性抑制剂)和PD98059(MEK1特异性抑制剂)预处理+缺氧培养,以蛋白质印迹法检测HCCR表达:将含HCCR启动子片段的荧光素酶报告基因质粒转染SMMC7721细胞,检测缺氧对HCCR启动子转录活性的影响.结果:缺氧环境下SMMC7721细胞中HCCR蛋白表达和转录活性均较常氧环境中升高,LY294002和PD98059可抑制缺氧环境下HCCR蛋白表达.结论:缺氧状态下人肝癌细胞株SMMC7721中HCCR蛋白表达和启动子转录活性增高.可能是肿瘤细胞在缺氧实体瘤组织中存活和快速增殖的重要机制之一.缺氧状态下HCCR蛋白表达受PI3K/Akt和MAPK这两条信号通路的调节.
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表皮生长因子诱导人胰腺癌细胞SW1990中人宫颈癌基因的表达及其机制
目的 研究表皮生长因子(EGF)诱导人胰腺癌细胞SW1990中人宫颈癌基因(HCCR)蛋白表达的分子信号通路机制.方法 100 ng/ml EGF作用SW1990细胞不同时间后,用Western blot检测其磷酸化AKT和HCCR蛋白表达情况；用LY294002(PI3 K/AKT抑制剂)预处理SW1990细胞后用EGF作用SW1990细胞,观察其HCCR蛋白表达情况.结果 Western blot结果显示,与对照组相比,细胞内磷酸化AKT表达水平在4h时明显升高(P＜0.05),而HCCR表达水平则随着EGF处理时间增加而升高(P＜0.05)；LY294002(PI3 K/AKT抑制剂)可阻断EGF诱导的HCCR蛋白表达.结论 EGF通过PI3K/AKT通路诱导人胰腺癌细胞SW1990中HCCR蛋白的表达,这一通路可被PI3 K/AKT抑制剂阻断.
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人宫颈癌基因反义核酸抑制肝癌细胞生长作用的实验研究
目的 探讨针对人宫颈癌基因(HCCR)反义核苷酸影响肝癌细胞增殖、凋亡的作用.方法 构建pcDNA3.1-HCCR反义真核表达质粒,转染HepG2细胞,实时定量PCR检测HCCR mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平,流式细胞仪观察HepG2细胞凋亡和细胞周期的变化,MTT法检测细胞的增殖活性.结果 HCCR反义核酸可有效抑制HepG2细胞HCCR的表达,与转染前相比,转染后24小时HCCR mRNA水平下降到16%,其蛋白表达水平在24小时也明显降低.对细胞的增殖与凋亡活性检测显示:转染HCCR反义质粒后,HepG2细胞增殖受到抑制,转染后24小时抑制率为47.62%(P＜0.05),细胞凋亡率为14.34%±0.91%,较对照组明显增多(t=21.799,P＜0.05),细胞分裂多停止在G0G1期.结论 HCCR反义核酸可以抑制HepG2细胞中HCCR的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,使细胞停滞于G1期.HCCR反义核酸用于肝癌细胞的基因治疗具有一定的潜在意义.
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HCCR mRNA在原发性肝细胞癌患者中的表达及临床意义
目的：探讨人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene，HCCR) mRNA在原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)患者中的表达及其临床意义。方法采用RT-PCR检测PHC癌组织、癌旁肝组织和肝硬化组织及各组外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中的HCCR mRNA表达水平，并进行分析。结果 HCCR mRNA 在PHC组织中的相对表达强度为0.83±0.10，癌旁肝组织中的相对表达强度为0.12±0.07，肝硬化组织中的相对表达强度为0.57±0.12，三组均数间两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。 PBMC中，肝癌患者HCCR mRNA的表达强度为0.55±0.06，肝硬化患者HCCR mRNA的表达强度为0.34±0.04，而正常人未检测出，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PHC和肝硬化患者的组织和PBMC中HCCR表达明显增高，HCCR基因可能参与了PHC的发生与发展，其与PHC的恶变演进有一定的相关性。
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人宫颈癌基因与肿瘤
人宫颈癌癌基因(HCCR)是在人宫颈癌中发现的新基因,在人类大多数肿瘤中都有表达.研究表明HCCR可作为肝癌、乳腺癌早期诊断的标记物,HCCR表达调节受促分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶通路的调节,利用基因干扰技术发现HCCR与肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润及迁移有关.
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HCCR重组蛋白的表达及其单克隆抗体的制备
目的:克隆人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)的c末端截短序列(膜外区序列),重组表达并纯化HCCR-C端蛋白,制备和初步鉴定针对HCCR-C端蛋白的单克隆抗体.方法:从人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA,RT-PCR扩增出HCCR-C端,构建其原核表达质粒,表达HCCR-C融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,常规细胞融合和选择性培养,亚克隆筛选出分泌特异抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水,Western blot、细胞组化初步鉴定抗HCCR-C端单克隆抗体.结果:成功克隆了HCCR-C末端截短序列,原核表达并纯化了HCCR-C端重组蛋白;经ELISA双筛,获得3株能稳定分泌抗HCCR-C端单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Western blot及细胞免疫荧光结果显示,其分泌抗体效价高且均能特异识别HCCR蛋白.结论:成功制备并初步鉴定了针对HCCR-C端的单克隆抗体,为深入研究HCCR蛋白的生物学功能和建立新的肝细胞癌早期诊断方法奠定了可靠基础.
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人宫颈癌基因在原发性肝细胞癌患者中的表达及其临床意义
目的：探讨人宫颈癌基因（HCCR）在原发性肝细胞癌患者中的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）技术检测60例原发性肝细胞癌和肝硬化、正常健康体检者血清中HCCR RNA 的表达，并分析其与临床病理特征的关系。结果外周血单核细胞（PBMC）中，肝癌患者 HCCR RNA的表达强度为0.515±0.092，肝硬化患者 HCCR RNA 的表达强度为0.348±0.064，而正常健康体检者 HCCR RNA无表达，差异均有统计学意义（P <0.05）。FQ-RT-PCR 结果显示肝癌患者检出率高，达83.33%，其次是肝硬化组（8.33%），而健康人对照组检出率为0。肝癌患者检出率与甲胎蛋白（AFP）表达量、门静脉癌栓、肿瘤分化程度、临床 TNM 分期等临床参数密切相关（P <0.05）。结论原发性肝细胞癌患者、肝硬化患者 PBMC 中 HCCR mRNA表达明显增高，HCCR 基因可能参与了原发性肝细胞癌的发生与发展，其与原发性肝细胞癌的恶变演进有一定的相关性。
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人宫颈癌基因在胃癌中的表达及其意义
目的 探讨人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)在人胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及其与临床病理特征的关系,初步评价HCCR在胃癌发生中的作用及其意义,为寻找胃癌新的诊断标志物另辟新径.方法 采用Western blot方法检测SGC-7901、BGC-823胃癌细胞系中HCCR蛋白表达;采用免疫组化法检测30例胃癌患者的癌组织和10例癌旁正常组织中HCCR蛋白表达.结果 HCCR蛋白在两种不同分化程度的胃癌细胞株中均有阳性表达;胃癌组织中HCCR阳性表达率为73.3%(22/30),其表达位于细胞的胞膜和胞质,10例癌旁正常组织均为阴性表达,两者差异具有统计学意义(P＜0.01).HCCR的表达与胃癌患者的年龄、性别、浸润深度、组织分型、肿瘤分化程度及有无淋巴结转移均无显著相关性(P＞0.05).结论 HCCR与胃癌的发生密切相关,可能是反映早期胃癌发生的重要生物学指标之一.
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人宫颈癌基因在结直肠癌和结直肠腺瘤组织的表达及其意义
目的 观察人宫颈癌基因(HCCR-1)在结直肠癌、腺瘤和正常黏膜中的表达,探讨其临床意义.方法 采用免疫组织化学及实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测HCCR-1在80例结直肠腺瘤、30例结直肠癌以及20例正常结直肠黏膜组织中的表达.结果 HCCR-1在正常结直肠黏膜组、结直肠腺瘤组及结直肠癌组织中表达水平的差异有统计学意义(P =0.001),阳性表达率分别为10.00％、62.50％、100.00％.在管状腺瘤、混合性腺瘤、绒毛状腺瘤组织中阳性表达率分别为46.70％、66.70％、80.00％,差异有统计学意义(P=0.015).FQ-PCR检测结果显示在正常对照组、管状腺瘤组、混合性腺瘤组、绒毛状腺瘤组及大肠癌组HCCR-1表达量分别为0.6092±0.326 1、4.0346±1.1884、12.353 4±2.828 0、22.563 7±78.952 0、43.202 9±7.675 4.结论 HCCR-1在结直肠腺瘤的恶变及结直肠癌的发生发生发展过程中起一定作用.
关键词： 结直肠腺瘤 结直肠癌 免疫组织化学 实时荧光定量聚合酶链反应 人宫颈癌基因 -
HBV相关性肝病患者HBsAg水平与HCCR、AFP的相关性及其肝功能指标的变化情况
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝病患者乙肝病毒表面抗原(HBsAg)水平与人宫颈癌基因(HCCR)、甲胎蛋白(AFP)的相关性及其肝功能指标的变化情况.方法 选取318例HBV相关性肝病患者为病例组,选取60例健康人群为对照组.比较两组HCCR、AFP检测结果 ,并分析HBsAg水平与HCCR、AFP的相关性;比较不同血清HBsAg水平患者以及不同HBV相关性肝病患者的HCCR、AFP检测阳性率;比较两组的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酸转肽酶(GGT)以及碱性磷酸酶(ALP)检测结果.结果病例组HCCR和AFP水平均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同HBsAg水平患者的HCCR与AFP水平均呈正相关关系(P<0.05);随着HBsAg水平的升高,HCCR、AFP水平和阳性率均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);乙型肝炎 、肝硬化 、原发性肝癌患者的HCCR、AFP阳性率依次显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);病例组ALT、GGT、ALP水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);原发性肝癌患者GGT水平显著高于乙型肝炎 、肝硬化患者,而ALT水平则显著低于乙型肝炎 、肝硬化患者,差异有统计学意义(P<0.05).结论 HCCR、AFP水平与HBsAg水平呈正相关,反映了HBV相关性肝病患者肝细胞病变的严重程度.对于HBsAg高水平患者,应联合检测HCCR、AFP以及早明确肝脏病变情况,提高肝癌的防治效果.
关键词： 乙型肝炎病毒相关性疾病 乙肝病毒表面抗原 人宫颈癌基因 甲胎蛋白 -
人宫颈癌基因蛋白在人肝细癌中的表达及其临床意义
人宫颈癌基因(HCCR)是新近确定的一种癌基因,定位于人染色体12q,编码HCCR-1和HCCR-2两种蛋白[1].HCCR不仅在宫颈癌组织中表达,而且在人其他肿瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、肝癌和子宫癌中均有过度表达[2],可作为肝癌及乳腺癌诊断的标志物[3].
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人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制
目的 利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因(HCCR)对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制. 方法 构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR,将其转染肝癌细胞株HepG2细胞,定量PCR、Westem blot检测HCCR及其相关基因的表达,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态,流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化. 结果 成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR,其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡增加.Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后,细胞内P53蛋白的表达降低,P15蛋白的表达明显升高,而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变. 结论 HepG2细胞中HCCR蛋白下调后,细胞增殖受到抑制,凋亡细胞增多,其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关.
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肝癌新标志物人宫颈癌基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备
目的构建表达截短型人宫颈癌基因(HCCR)-1蛋白的质粒,并进行原核表达、多克隆抗体制备.方法用逆转录聚合酶链反应法从HepG2细胞中扩增HCCR-1167～360cDNA,将其克隆到原核表达载体pRSET-B上,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并采用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组织化学检测抗体的灵敏度和特异性.结果成功地构建了表达HCCR-1167～360蛋白的质粒,原核表达后纯化得到了分子量约为2.70×104的目的蛋白,用之免疫BALB/c小鼠获得了高效价的特异性多克隆抗体.结论所获得的重组HCCR-1167～360蛋白纯度高,免疫原性强.获得的抗HCCR-1167～360多克隆抗体有较高的效价和较好的特异性,为HCCR的临床检测和研究奠定了基础.
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人宫颈癌基因对原发性肝癌的诊断价值
目的 评价人宫颈癌基因(HCCR)在原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)诊断中的作用.方法 分析40例原发性肝癌患者、40例慢性肝病患者与40名体检者血清中HCCR的水平,应用受试者工作特性曲线(ROC)对HCCR检测结果进行分析评价.结果 ①40例肝癌组HCCR浓度(136.850 IU/L±74.671 IU/L)高于肝病组(65.165IU/L±18.359 IU/L)和对照组(71.368 IU/L±16.014 IU/L),差异有统计学意义(P=0.000).②HCCR、AFP诊断原发性肝癌ROC曲线下面积分别为0.863、0.973.③在诊断原发性肝癌方面,HCCR与AFP无明显相关性(r=0.268,P=0.003).结论 HCCR对PHC有重要的诊断价值,且与AFP无明显相关性,可作为AFP的补充诊断PHC.
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人宫颈癌基因(HCCR)在消化系肿瘤中的研究进展
人宫颈癌基因是新近发现的一种与多种肿瘤发生相关的原癌基因,研究发现与人类多种肿瘤的发生发展关系密切,可以作为诊断肝癌、乳腺癌的肿瘤标记物,本文对其在消化系肿瘤中的研究进展作简要概述.
