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结核杆菌H37Rv株重组KatG蛋白的表达纯化研究
目的 表达纯化结核杆菌H37Rv株重组KatG(简称rKatG)蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础.方法 重组质粒pET23b-KatG转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rkatG蛋白表达.经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达条件,用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rKatG蛋白,对纯化产物进行过氧化氢酶活性测定.结果 成功构建了重组质粒pET23b-KatG,rKatG蛋白以可溶性蛋白形式表达,经亲和层析后的rKatG蛋白纯度为95.6%,过氧化氢酶试验阳性.结论 构建的pET23b-KatG重组质粒能高效表达有酶活性的可溶性rKatG蛋白,经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白.
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结核分枝杆菌katG、inhA、ahpC等突变与异烟肼耐药关系的研究
目的：了解结核分枝杆菌katG、inhA、ahpC、fabG1、sodA及sodC基因突变的特征及其与耐异烟肼的关系。方法对127例活动性肺结核患者痰标本进行菌型鉴定及结核分枝杆菌药敏试验，提取结核分枝杆菌菌株DNA，应用PCR扩增katG、inhA及ahpC、fabG1、sodA及sodC基因片段，并进行DNA序列分析。结果结核分枝杆菌药物敏感试验显示127株结核分枝杆菌中，其中47株耐异烟肼，80株对异烟肼敏感，耐异烟肼率为37.01%。47株耐异烟肼中，29株存在katG和（或）inhA基因突变，其中22株（46.81%，22/47）存在katG基因单位点突变，3株（6.38%，3/47）存在inhA基因单位点突变，4株（8.51%，4/47）存在katG及inhA基因联合位点突变。22株katG基因单位点突变中，20株为AGC315ACC、AGC315AAC （42.55%，20/47）突变，2株（2.13%，1/47）分别为CTG378CCG（Leu378Pro）、ACG394ATG（Thr394Met）突变，该突变位点及突变形式尚未见文献报道。18株katG及inhA未突变结核分枝杆菌均未检测到ahpC、fabG1、sodA及sodC基因突变。结论结核分枝杆菌对异烟肼耐药主要与katG和inhA基因突变有关。耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株378和394新突变位点的发现为进一步研究耐药机制以及耐药结核病的快速检测提供了依据。
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异烟肼耐药突变katGS315T与日本大阪地区MDR-/XDR-TB患病率的相关性
目的:研究异烟肼耐药的结核分枝杆菌中katGS315T突变的发生情况,并探讨katGS315T突变与耐多药结核病(MDR-TB)患病率之间的相关性.设计:收集了从2001年到2004年间所有到大阪市呼吸与过敏性疾病医学中心就诊的新登记病人的临床分离株1655株,并进行了药物敏感性分析.对1655株菌株中的1629株(98.4%)应用插入序列(IS)6110-限制性片段长度多态性(RFLP)法进行了基因分型.对所有耐异烟肼的145个临床分离株,包括耐多药菌株,都进行了katGS315T的突变情况检测.结果:560(34.4%)株临床分离株有相同的RFLP图谱.在145个INH耐药的分离株中,18/48(37.5%)属于有katGS315T突变的RFLP簇,23/97(23.7%)没有发生此突变.在66个耐多药结核病病例中,18/29(62.1%)属于有katGS315T突变的RFLP簇,11/37(29.7%)没有发生此突变.在29例广泛耐药病例(XDR)中,17/21(80.9%)属于有katGS315T突变的RFLP簇,3/8(37.5%)没有发生此突变.结论:发生katGS315T突变的MDR-/XDR-TB分离株中应用IS-RFLP分析获得的成簇率非常高.我们的研究表明katGS315T突变与MDR-TB,尤其是XDR-TB的传播动力学高度相关.
关键词： MDR-TB XDR-TB 异烟肼耐药 KatG IS6110-RFLP -
天津市耐异烟肼或利福平的结核分枝杆菌相关基因突变特征
目前已知多个基因突变与MTB对异烟肼和利福平的耐药有关,但是不同的基因密码子突变率存在地区差异.为此,我们检测了天津市结核病患者异烟肼耐药株katG和inhA启动子以及利福平耐药株rpoB的突变情况,探讨其耐药相关基因的突变特征及基因突变与耐药表型的相关性.
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煤工尘肺结核病耐药性的研究
目的了解煤工尘肺结核患者所染结核杆菌对异烟肼、利福平及链霉素耐药情况和基因突变情况,以便探寻更有效的药物治疗方法.方法从96份尘肺结核患者痰标本中分离出结核杆菌,测定异烟肼、利福平及链霉素的耐药情况,并用聚合酶链反应-单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)扩增出KatG、rpoB及rpsL片段,再将这些片段的8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图与标准株的电泳图进行对照分析.结果常规药敏试验检测出各种耐药株共67株,其中链霉素、利福平和异烟肼的耐药株构成比分别为80.5%(54/67)、58.2%(39/67)和50.7%(34/67);经PCR-SSCP法分析,66株(98.5%)rpsL泳动异常,47株(70.1%)出现rpoB泳动异常,42株(62.7%)KatG泳动异常.结论大部分尘肺结核患者的结核杆菌耐药分离株有基因突变,其突变率高于常规药敏试验结果.
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吉林省耐多药结核分枝杆菌rpoB及katG基因突变特征分析
目的 分析吉林省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB、katG基因突变特点,为建立本省快速耐多药检测方法提供参考.方法 对吉林省耐多药结核分枝杆菌菌株扩增rpoB、katG基因测序后比对分析.结果 耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG基因的突变率分别为83.53%和70.6%,突变类型包括点突变、联合突变和缺失.在rpoB基因中,82.30%突变发生在RRDR区域,常见突变位点为rpoB531、rpoB526、rpoB516.KatG基因突变率为70.6%,常见突变位点为katG315,占所有突变的68.55%.结论 吉林省耐多药结核分枝杆菌常见突变位点为rpoB531、rpoB526、rpoB516和katG315.
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点突变对结核分支杆菌KatG蛋白活性和结构的影响
目的探讨点突变对结核分支杆菌KatG蛋白过氧化氢-过氧化物酶活性和蛋白结构的影响,深入研究INH耐药的发生机制.方法采用三步法PCR对KatG基因的4个位点进行定点诱变,在大肠埃希菌BL21体系中表达和纯化相应诱变蛋白,并测定其过氧化氢酶、过氧化物酶活性、二硫键的形成及荧光光谱变化,后利用酵母细胞色素C氧化酶模型进一步探讨点突变对KatG蛋白过氧化氢-过氧化物酶活性和结构的影响.结果完成KatG基因4个位点的诱变及相应诱变蛋白的表达和纯化.过氧化氢酶、过氧化物酶活性测定发现3个诱变蛋白[KatG(W321G)、KatG(R418Q)和KatG(A456S)]活性基本丧失,诱变蛋白KatG(S315T)活性也有明显下降.荧光光谱显示KatG(R418Q)和KatG(A456S)的荧光强度较野生型明显降低.4个点突变均不影响KatG蛋白间二硫键的形成.结论所引入的4个突变可能对KatG蛋白的结构造成影响,从而导致KatG蛋白的功能即过氧化氢-过氧化物酶活性下降.
关键词： 结核分支杆菌 KatG 过氧化氢-过氧化物酶 荧光光谱 酵母细胞色素C氧化酶 -
结核分枝杆菌katG、rpoB、rpsL耐药基因快速检测方法的建立
目的:建立一套应用multi-PCR-SSCP(multiple-Polymerase Chain Reaction-Single Strand Cinformation Polymorphism)快速检测结核分枝杆菌耐药基因突变的方法,评价该方法的临床应用价值.方法:分别用常规PCR和multi-PCR-SSCP检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB、rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比.结果:经常规药敏试验检测,58株结核分枝杆菌临床分离株中有41株耐药,其中,耐异烟肼(INH)35株;耐利福平(RFP)31株;耐链霉素(SM)31株.单基因PCR-SSCP与multi-PCR-SSCP分析结果一致,检出katG,rpoB、rpsL基因的突变率分别为65.7%(23/35)、84%(26/31)、71%(22/31),17株药物敏感株中有1株rpoB基因SSCP电泳条带与结核杆菌标准株结果有差异. 结论:multi-PCR-SSCP方法敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌katG、rpoB、rpsL耐药基因的突变,将该方法与药敏试验联合应用可互相弥补,成为临床指导用药的好方法.
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应用膜反向斑点杂交技术检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型
目的 应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(INH)耐药性.方法 设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH kat、inhA基因的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交.结果 20株INH敏感株中,仅9例出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示KatG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示KatG基因315位密码子AGC→ACC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inhal探针杂交阳性,PCR-DS显示inhA基因-15位C→T突变.36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示KatG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inhal探针阳性杂交,25株野生型探针inhl杂交阳性.KatG基因膜杂交突变检出率为50%,inhA基因膜杂交突变检出率为30.56%.结论 膜反向斑点杂交技术可成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法.
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广西百色地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药基因特征
目的：分析百色地区结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB及异烟肼耐药相关基因KatG、inhA的突变特征。方法：收集128例结核病患者痰液标本，分离培养结核分枝杆菌并检测利福平及异烟肼耐药性，提取耐药菌株DNA，分析耐药相关基因突变特征。结果：耐利福平菌株rpoB基因突变率为75％（27／36），531位点突变率为59．3％（16／27）。耐异烟肼菌株KatG、inhA基因突变率为44．1％（15／34），其中315位点突变率为66．7％（10／15），出现2个新的突变位点279（4／15）和427（1／15）。 inhA 5位点突变率为13．3％（2／15），inhA 16位点突变率为6．7％（2／15），3株为KatG和inhA联合突变。结论：百色地区耐多药结核分枝杆菌耐药性产生与rpoB、katG和inhA基因突变相关，检测本地区结核分枝杆菌耐多药相关基因突变为进一步研究耐药机制及耐药结核病的快速检测提供依据。
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结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因LiPA检测研究
目的 利用LiPA技术检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因,评价LiPA技术临床应用的可行性.方法 应用比例法确定80株结核分枝杆菌临床分离株其耐药性,用katG基因PCR扩增产物进行DNA测序,然后用LiPA检测技术检测结核分枝杆菌katG基因的突变,对比3种方法的检测结果,评估LiPA检测技术的准确性.结果 在80株结核分枝杆菌中,35株为异烟肼敏感株,45株为异烟肼耐药株.敏感株katG基因扩增阳性率为100%,耐药株为91.1%(41/45).耐异烟肼菌株katG的缺失率为8.9%.41株扩增阳性耐药株中有26株检测到315位密码子的突变,分别为ACC(60.97%,25/41),ATC(2.44%,1/41),无突变(36.58%,15/41).LiPA技术检测、药物敏感性试验和基因测序的结果基本一致.结论 结核分枝杆菌katG基因突变的LiPA技术敏感性高.特异性强,可用于结核分枝杆菌的快速药物敏感性试验评价.
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广西百色地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因特征分析
目的：分析百色市地区结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因 KatG 、inhA 的突变特征。方法收集128例结核病患者痰液标本，采用改良罗氏培养基分离培养结核分枝杆菌，绝对浓度法检测异烟肼耐药性，提取耐药菌株 DNA ，PCR 扩增耐药结核分枝杆菌 katG 、inhA 基因序列并分析异烟肼耐药相关基因突变特征。结果分离培养出98例结核分枝杆菌，34株对异烟肼耐药，耐药率为36．7％，耐药菌株 KatG 基因突变率为44．1％（15／34），其中315位点突变率为66．7％（10／15），出现两个新的突变位点为279（4／15）和427（1／15）。 inhA 5位点突变率为13．3％（2／15），inhA 16位点突变率为6．7％（1／15），3株均为 katG 和inhA 联合突变。结论百色地区耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性产生与 katG 和 inhA 基因突变相关，检测本地区结核分枝杆菌katG 和 inhA 基因突变可预测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性。
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合肥地区异烟肼耐药结核分枝杆菌KatG基因突变的分子特征
目的 了解合肥地区结核分枝杆菌异烟肼(Isoniazid,INH)耐药株katG基因突变特点.方法 应用PCR-直接测序法对合肥地区肺结核病人痰液中分离的86株结核分枝杆菌的katG基因731bp序列进行测定分析.结果 86株结核分枝杆菌中67株对INH耐药,19株对INH敏感；67株耐INH临床分离株中PCR成功扩增61株,其中56株发生katG基因突变,突变率为91.8％ (56/61)；katG基因发生联合突变的有30株,突变率为49.2％ (30/61),26株发生katG基因单位点突变,突变率为42.6％ (26/61).突变位点主要集中在463位精氨酸和315位丝氨酸,突变率分别为93.4％(57/61)和42.6％ (26/61).而在19株INH敏感株中发现有78.9％ (15/19)株存在Arg4631eu突变,突变形式与INH耐药株相同.结论 在合肥地区,KatG基因315位密码子突变是菌株INH表型耐药的重要分子基础,以Ser315Thr错义突变为主.KatG基因463位密码子突变与INH耐药表型没有相关性,不是结核杆菌INH耐药的分子标志.该位点突变可能是基因多态性,与结核菌治疗带来的选择性压力无关.
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结核分枝杆菌及其稳定L型的katG基因研究
目的探讨细胞壁缺陷对结核分枝杆菌异烟肼敏感性的影响以及结核分枝杆菌细胞壁缺陷形成异烟肼耐药性的分子基础.方法采用非高渗培养基体外药敏试验,检测自发形成及诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型的异烟肼敏感性;用异烟肼耐药性相关结构基因KatG的特异性引物,对自发形成及诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型及其亲代细菌型的染色体DNA进行PCR扩增与序列分析.结果不论对异烟肼敏感还是耐药的结核分枝杆菌自发或诱导形成稳定L型后,都能够在含0.2μg/ml异烟肼的非高渗液体培养基内生长和传代培养.结核分枝杆菌稳定L型katG基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,可见形成与其亲代细菌型一致的DNA条带.PCR-DS分析结果显示,结核分枝杆菌稳定L型katG基因扩增产物具有与其细菌型相同的核苷酸序列.结论无论是自发形成的还是异烟肼诱导形成的结核分枝杆菌稳定L型都可形成异烟肼耐药性,但其katG基因的核苷酸序列并没有发生改变.提示结核分枝杆菌稳定L型的异烟肼耐药性与katG基因突变无关,细胞壁缺失也是导致结核分枝杆菌形成异烟肼耐药性的一个重要机制.
