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婴儿双歧杆菌介导的双自杀基因CD/UPRT对鼠黑色素瘤细胞的杀伤效应
目的探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应.方法 PCR扩增大肠杆菌UPRT基因,构建原核表达质粒pGEX-UPRT;以电穿孔法将该质粒转入婴儿双歧杆菌,筛选阳性重组菌并鉴定;采用MTT法检测表达的UPRT可否与CD产生抗瘤协同作用.结果重组婴儿双歧杆菌可以正确表达UPRT.体外MTT检测显示CD+UPRT组细胞存活率明显低于对照组(P＜0.01),且可使B16-F10鼠黑色素瘤细胞对5-FC杀伤敏感性(IC 50＝0.015 μmol·ml-1)显著提高,是CD组(IC 50＝0.127 μmol·ml-1)的8.5倍.结论婴儿双歧杆菌联合转导UPRT基因可显著增强CD/5-FC自杀基因系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用.
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婴儿双歧杆菌介导的CD和UPRT联合5-FC基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验研究
目的 采用婴儿双歧杆菌为载体,探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPRT)对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应.方法 构建原核表达质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法将该质粒转化入婴儿双歧杆菌,筛选阳性重组菌并鉴定.采用MTT法检测表达的UPRT是否可以与CD产生抗瘤协同作用,并观察细胞形态学改变.结论 重组婴儿双歧杆菌可以正确表达UPRT.体外MTT检测显示CD+UPRT组细胞存活率低于对照组(P＜0.01),且可使B16-F10鼠黑色素瘤细胞对5-FC的杀伤敏感性(IC50＝0.015 μmol/mL)提高,是CD组(IC50＝0.127 μmol/mL)的8.5倍.形态学观察CD+UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制,而UPRT组和CD组变化明显不如前者.结论 婴儿双歧杆菌联合转导UPRT基因可明显增强CD/5-FC自杀基因系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用.
关键词： 婴儿双歧杆菌 尿嘧啶磷酸核糖转移酶 胞嘧啶脱氨酶 基因治疗 -
婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因系统对黑色素瘤的抑瘤实验
目的观察婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统对黑色素瘤的体内、外抑瘤效果.方法含重组CD基因的婴儿双歧杆菌中加入5-FC,厌氧条件下培养24 h后取其上清液,加到黑色素瘤B16-F10细胞上,观察其对细胞形态及细胞生长抑制率的影响;建立小鼠黑色素瘤动物模型,尾静脉注入含重组CD基因的婴儿双歧杆菌,腹腔注入5-FC,观察携带重组CD基因的婴儿双歧杆菌联合5-FC对黑色素瘤肿瘤体积及肿瘤体积倍增时间的影响.结果①体外实验:实验组肿瘤细胞形态显示出显著的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制,而对照组肿瘤细胞影响不大.②小鼠黑色素瘤动物模型实验结果显示,经重组婴儿双歧杆菌联合5-FC治疗21 d,实验组肿瘤倍增时间明显长于对照组,其肿瘤体积明显小于对照组,且随着观察时间的延长,这种差异越显著.结论婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC自杀基因系统对黑色素瘤具有明显的抑瘤效果.
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腺病毒载体介导的CD基因转移联合5-FC对大鼠卵巢癌细胞株的作用研究
目的研究胞嘧啶脱氨酶(CD)基因转移及其与5-氟胞嘧啶(5-FC)联合应用对卵巢癌细胞株生长的影响.方法用复制缺陷型重组腺病毒为载体,将CD基因转染大鼠卵巢癌细胞株NUTU-19细胞,加入含5-FC的培养液培养.MTT法检测培养孔吸光度值,计算细胞存活率.结果 5-FC对转染了CD基因的NUTU-19细胞的生长抑制作用显著增强,并随着腺病毒滴度和5-FC浓度的增加,该作用不断增强.此外,5-FC可通过旁观者效应杀伤CD基因转染细胞周围未转入该基因的NUTU-19细胞.结论 CD基因转移联合5-FC作用对NUTU-19细胞具有显著的杀伤作用.
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恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD/5-FC自杀基因治疗系统的建立
目的建立针对恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统.方法以大肠杆菌大量扩增制备含有胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的pCMVCD质粒并经酶切电泳鉴定.DNA序列测定证实pCMVCD质粒是否含有所需要之CD目的基因.用Lipofectamine2000脂质体介导法将pCMVCD质粒转染进入SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞,经G418筛选获得抗性克隆(定名为SHG-44/CD细胞).结果 pCMVCD质粒经测序证实含有CD目的基因.脂质体介导pCMVCD质粒成功转染了SHG-44细胞.结论建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD/5-FC自杀基因治疗系统,为后续实验研究打下了基础.
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人天然免疫蛋白载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(APOBEC3A)的克隆表达及活性鉴定
目的 构建载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(APOBEC3A)表达载体,真核细胞表达APOBEC3A并鉴定其胞嘧啶脱氨酶活性.方法 构建APOBEC3A真核表达载体pcDNA3.0-APOBEC3A,转染HEK293T细胞和HepG2细胞.Western blot法鉴定APOBEC3A蛋白表达,免疫荧光细胞化学染色确定APOBEC3A在HEK293T细胞和HepG2细胞的定位,利用组蛋白(His)标签蛋白纯化方法富集纯化APOBEC3A蛋白,荧光偏振技术检测APOBEC3A脱氨酶活性.结果 DNA测序证实pcDNA3.0-APOBEC3A插入长600 bp的APOBEC3A基因序列;该质粒能在HEK293T细胞和HepG2细胞表达APOBEC3A,APOBEC3A在HEK293T细胞中主要分布于胞质,在HepG2细胞中胞质和胞核均匀分布;纯化获得的APOBEC3A对单链DNA中TTCA序列具有胞嘧啶脱氨基活性.结论 成功构建APOBEC3A真核表达载体,APOBEC3A在HEK293T细胞和HepG2细胞定位不同,表达的APOBEC3A具有胞嘧啶脱氨基活性.
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前药 5-FC 联合胃泌素拮抗剂 CI-988 对转 CD 基因大肠癌 SW480细胞的杀伤作用
目的:探讨联合应用前药 5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)和胃泌素拮抗剂 CI-988 对转组织特异性胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase,CD)基因的大肠癌 SW480 细胞生长的影响.方法:将转 CD基因大肠癌 SW480 细胞接种至4块24孔细胞培养板中,依次分为实验组1、2、3及对照组,分别以含有前药5-FC、胃泌素拮抗剂 CI-988、5-FC 联合 CI-988 及正常培养液进行培养.每天胰酶消化法计数各组4孔,共6d,绘制细胞生长曲线并计算生长抑制率.按上述分组方法另接种培养4组细胞,于培养72h行MTT法检测490nm处吸光度A值,计算细胞杀伤率.结果:应用 5-FC 联合 CI-988 处理的转 CD 基因大肠癌 SW480细胞在6d后生长抑制率达97%;于培养72h时,实验组1、3细胞杀伤率较对照组有显著性差异(P＜0.01);实验组2与对照组无显著性差异(P＞0.05);实验组3较实验组1、2有显著性差异(P＜0.01).结论:CD/5-FC 系统和胃泌素拮抗剂 CI-988 对转基因大肠癌 SW480 细胞具有杀伤或抑制作用,联合应用胃泌素拮抗剂可以提高 CD/5-FC 自杀基因系统对大肠癌细胞的杀伤效应.
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胞嘧啶脱氨酶自杀基因转染SHG-44胶质瘤细胞的实验表达研究
目的 以含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组表达质粒(recombinant plasmid vector)pCMVCD转染SHG-44胶质瘤细胞,建立胶质瘤嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统.方法 体外扩增、酶切鉴定pCMVCD质粒并采用DNA序列测定pCMVCD质粒中的CD基因;改良Eagle培养基(DMEM)培养SHG-44胶质瘤细胞;脂质体lipofectamine2000介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞,G418筛选重组子;免疫细胞化学检测表达情况.结果 测序证实PCMVCD质粒含有CD基因;脂质体成功介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞,获取了抗性细胞克隆(定名SHG-44/CD细胞);免疫细胞化学染色显示SHG-44/CD细胞成功地表达了CD.结论 脂质体介导pCMVCD质粒转染SHG-44细胞的方法简单、高效;成功建立了胶质瘤CD/5-FC自杀基因治疗系统,为后续实验研究打下了基础.
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Fe3O4磁性纳米颗粒/CD/5-FC系统对U251细胞化疗作用
目的:建立以Fe3O4磁性纳米颗粒(Fe3O4,MNP)/胞嘧啶脱氨酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FC)系统为基础的神经系统胶质瘤治疗方法.方法:利用高温分解铁有机物法以2-吡咯烷酮和乙酰丙酮铁为原料制备出Fe3O4MNP,用γ-氨丙基三乙氧基硅烷对磁性材料进行表面修饰.以Fe3O4MNP为载体将CD基因转染U251胶质瘤细胞,检测Fe3O4MNP对质粒pCMVCD的结合与保护能力.通过RT-PCR,Western Blot法和免疫荧光等方法检测CD基因在U251细胞的表达.噻唑蓝(MTT)法检测5-FC化疗后U251-CD细胞生长曲线的变化.结果:制备出粒径为(10±2)nnl的Fe3O4MNP;使用Fe3O4MNP作为载体将CD基因成功转染U251细胞;脂质体转染组转染率为(39.23±12.12)%,而示Fe3O4 MNP转染组转染率为(67.35±11.19)%,2组相比较差异显著(P<0.01).Fe3O4MNP作为载体转染的U251-CD细胞CD基因稳定表达,并呈时间相关性增强表达模式;U251-CD细胞加入5-FC后能显著抑制U251细胞生长.结论:Fe3O4MNP可作为胶质瘤基因治疗的理想载体;Fe3O4MNP/CD/5-FC系统可作为脑胶质瘤辅助治疗手段之一.
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腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合α-IFN治疗肾癌的实验观察
目的:探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因联合α-IFN对肾癌的治疗作用.方法:含CD基因重组腺病毒感染人肾癌细胞株786-0,用噻唑蓝(MTr)方法观察加用5-氟胞嘧啶(5-Fc)或联用α-IFN后的杀伤效应.建立786-0裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射腺病毒,腹腔注射5-Fc(500me/kg),联合应用α-IFN时行瘤内注射,观察肿瘤生长情况.结果:在对感染腺病毒的786-0细胞的体外杀伤实验中,CD+5-Fc组的细胞存活率为(67.40±1.27)%,α-IFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%,CD+5-Fc+α-IFN组细胞存活率为(34.67±2.38)%,(P=0.000),两者之间有协同效应.在786-0裸鼠移植瘤模型中,CD+5-Fc联合α-IFN能够显著抑制肿瘤的生长.结论:腺病毒为载体的自杀基因CD加前体药5-Fc联合α-IFN可以明显增强抗肾癌效果.
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组织特异性胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶热化疗对裸鼠结肠癌肝脏转移的影响
目的 探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对裸鼠结肠癌肝脏转移的影响.方法 将45只裸鼠按随机数字表法分为3组:对照组、非热疗组、热疗组,每组15只.门静脉注射法建立结肠癌肝脏转移动物模型,3组分别给予不同的治疗方法.采用χ2检验和单因素方差分析3组肝脏肿瘤转移率、转移数目;观察各组病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数;荧光定量RT-PCR和Westernblot检测肿瘤组织中CD基因的表达情况.结果 对照组、非热疗组、热疗组肝脏平均转移癌结节数目和转移率分别为(4.6±1.3)、(2.2±1.0)、(0.5±0.8)个和100.0%、60.0%、13.3%,3组比较差异有统计学意义(F=25.898,χ2=5.208,19.548,5.168,P<0.05);肿瘤细胞凋亡指数平均为4.6%、9.9%和17.4%.热疗组可见大量细胞空泡变性、坏死、溶解现象,有较多的凋亡小体形成.3组均可以检测到CD基因的表达.结论 组织特异性CD/5-FC系统热化疗对转CD基因结肠癌LoVo细胞裸鼠肝脏转移有明显的抑制作用.
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TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统治疗结肠癌的实验研究
目的 观察胸苷激酶/丙氧鸟苷(TK/GCV)、胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-Fc)双自杀基因系统对结肠癌的治疗效果,并结合研究结果进行作用机理的分析.方法 采用培养细胞移植法,将人结肠癌细胞系SW480接种于裸鼠背部皮下,建立裸鼠人结肠癌移植瘤模型.将32只裸鼠随机分为4组:空白对照组,TK/GCV治疗组,CD/5-Fc治疗组,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组,每组8只.TK/GCV+CD/5-Fc采用逆转录病毒介导,采用瘤体内直接注射法,同时腹腔注射GCV、5-Fc治疗,观察各组小鼠的生存状况及肿瘤体积、瘤重、肿瘤生长抑制率、常规病理、生存期等指标,比较观察各治疗组的治疗效果及对荷瘤裸鼠存活的影响.结果 各治疗组裸鼠人结肠癌移植瘤的生长均受到显著抑制,治疗后各组体积数增加(P＜0.05),治疗组裸鼠存活期显著延长,TK/GCV+CD/5-Fc联合治疗组效果好,疗效q值=1.675＞1.15,即TK/GCV、CD/5-Fc有交互协同作用.结论 TK/GCV与CD/5-Fc对人结肠癌SW480细胞有明显抑制作用,TK/GCV、CD/5-Fc双自杀基因系统效果更强.
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CD、TK双自杀基因对消化道肿瘤细胞的体外抑制作用
目的用粘粒法构建含有胞嘧啶脱氨酶(CD)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)双自杀基因的腺病毒载体,检测双自杀基因对不同消化道恶性肿瘤细胞的体外抑制作用.方法利用重组腺病毒载体介导的CD、HSV-tk融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、胃癌细胞系SGC-7901、肝癌细胞系BEL-7402,通过MTT法测定细胞存活率,通过细胞集落形成实验分析GCV(丙氧鸟苷)、5-FC(5-氟胞嘧啶)双前药(double prodrugs)对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应的大小.结果 Western Blot检测分析融合基因的表达,显示重组腺病毒介导的双自杀基因可以在3种肿瘤细胞中高效表达.使用前药GCV和5-FC后,各组肿瘤细胞的集落形成和细胞存活率显著低于对照组.感染细胞在混合细胞中比例较低时,就能获得明显的旁观者效应.联合两种前药能获得大的细胞抑制作用,并且CD/5-FC系统对于消化道肿瘤细胞的杀伤作用强于HSV-tk/GCV系统.结论 CD、TK融合基因联合双前药治疗对消化道肿瘤有显著的体外抑制作用.
