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转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较
背景:以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养,诱导方式主要集中于细胞因子的方法,而椎间盘体内微环境,除细胞因子对细胞影响外,在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究.目的:在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导,观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异.方法:分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞,脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后,按5×106个细胞制成微球,置于Transwell培养板中培养,分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导;于诱导前、诱导7,14 d,观察细胞形态变化,并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定.结果与结论:在体外诱导7,14 d,两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别.RT-PCR检测结果显示7 d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达,但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强;诱导14 d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高,优于转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组.结果表明,在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子,说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外,尚存在相互促进增殖分化作用.
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原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞
背景:髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9 等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化.目的:体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞.方法:经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar 大鼠椎间盘髓核组织,第1,2 代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞.结果与结论:分离纯化后的第3 代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan 免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8 生长曲线显示细胞经过2d 的生长潜伏期,3d 的指数生长期,进入生长停滞期.说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致.
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富血小板血浆治疗椎间盘退变:从基础研究到临床应用
背景:椎间盘退变是下腰痛的常见原因,椎间盘内的微环境和细胞环境发生变化是诱发椎间盘退变的重要因素,但目前仍无确凿证据表明退变发生的机制.目的:针对当前富血小板血浆治疗椎间盘退变的研究概况做一综述.方法:设计综述的撰写结构,在万方数据库和PubMed数据库中分别输入中、英文检索词,分析所得文献的摘要及内容,通过纳入和排除得到相关文献.结果与结论:尽管手术治疗中晚期椎间盘退变有显著疗效,但对于早期退变,仍没有较好的保守治疗方法.富血小板血浆可以促进组织愈合和再生,已被诸多学者用于椎间盘退变模型的治疗中.细胞学实验及动物实验证明,富血小板血浆可以有效延缓甚至逆转椎间盘早期退变;临床试验表明,下腰痛患者接受富血小板血浆治疗后疼痛有所改善,将富血小板血浆和其他生物学治疗结合,能够显著改善椎间盘退变.目前的大多数实验都局限于细胞学和动物学研究,临床治疗的报道少之又少,加之富血小板血浆的提取方法、注射剂量以及佳注射时间都无统一标准,而对富血小板血浆治疗的不良反应也知之甚少,故富血小板血浆治疗椎间盘退变的疗效有待于进一步验证.
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细胞移植及髓核组织工程重建修复椎间盘退变
背景:通过细胞组织工程将细胞或细胞支架复合体植入退变缺损的椎间盘内,使退变的椎间盘再生可能是治疗椎间盘退变性疾病为理想的方法.目的:评价组织工程髓核体内移植抑制腰椎间盘退变的临床疗效及应用前景.方法:由第一作者检索1990/2010 PubMed数据、中国知网及万方数据库有关组织工程髓核、组织工程材料及骨髓间充质干细胞治疗腰椎间盘退变方面的文献.结果与结论:目前常用的细胞支架主要包括胶原支架、琼脂糖支架、藻酸盐支架、聚乙醇酸支架与壳聚糖支架以及复合材料等.通过自体椎间盘细胞或间充质干细胞结合基因技术筛选种子细胞,进行细胞和/或细胞支架复合体移植恢复或再生相关细胞外基质的合成,通过逆转和修复椎间盘细胞病理性改变,为退变的椎间盘组织和功能恢复提供了全新的治疗策略.
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髓核细胞移植抑制椎间盘退变
背景:近年来,椎间盘细胞移植和椎间盘移植修复椎间盘退变研究取得较大的进展.目的:探讨髓核细胞的体外培养方法以及髓核细胞移植在抑制椎间盘退变研究中的作用.方法:通过数据库检索的方式探讨髓核细胞移植抑制椎间盘退变的研究.髓核细胞的主要功能是产生胶原和蛋白聚糖,改进髓核细胞的培养方法,使培养后的髓核细胞数量增多,合成和分泌细胞外基质增加,通过髓核细胞移植来修复退变的椎间盘.结果与结论:通过三维小球聚集培养、微载体旋转立体培养等方法可以使髓核细胞数量增多,肝细胞生长因子对髓核细胞增殖产生促进作用.髓核细胞移植可以恢复退变椎间盘高度,促进退变椎间盘内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的生物合成和分泌.随着对椎间盘退变研究的不断深入,髓核细胞移植对退变椎间盘可能是一种重要的治疗手段.
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非接触共培养条件下骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化
背景：组织工程中间充质干细胞治疗椎间盘退变性疾病为退变椎间盘结构和功能恢复提出了一种新型的治疗方案，是目前研究的热点。
目的：分析兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能。
方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞与兔髓核细胞按培养要求分为3组：普通6孔板单纯培养骨髓间充质干细胞组，普通6孔板单纯培养髓核细胞组，骨髓间充质干细胞与髓核细胞共培养组，Transwell 6孔板底部接种第3代骨髓间充质干细胞，上层接种第3代髓核细胞。倒置显微镜观察各组细胞形态的变化，在培养第7天采用免疫细胞化学、RT-PCR及Western blot技术测定各组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。
结果与结论：①共同培养第7天，骨髓间充质干细胞呈多角形、短梭形改变，无纤维样变化，形态接近髓核细胞；②共培养组骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达与单独培养髓核细胞组相近，显著高于单独培养骨髓间充质干细胞组；③结果表明，非接触共培养条件下，髓核细胞具有诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的潜能，为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供大量的细胞来源。 -
sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达
背景：与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比，将基因通过慢病毒转染入宿主细胞，可以得到长期高效的持续表达，采取双/多基因共修饰治疗的策略，较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。
目的：构建 sox9基因慢病毒载体以及 LMP1基因慢病毒载体，并共转染兔骨髓间充质干细胞，观察 SOX9和LMP1基因的表达情况。
方法：双酶切从 GeneArt 提供的含 sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体，获得含sox9基因的质粒pLMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列，并克隆到pLenti6.3_MCS_IRES2-DsRed-Monomer载体，获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP)，以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞，观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。
结果与结论：测序结果显示质粒 pLMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致，成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达，RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在mRNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带 sox9基因的 Lenti-SOX9-GFP 慢病毒载体，以及红色荧光蛋白的携带 LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体，为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。 -
骨膜细胞与髓核细胞共培养向成骨方向的分化
背景：骨膜细胞已被应用于骨缺损及修复，但其可否在成骨诱导环境中与髓核细胞共培养向成骨分化，并应用于椎间隙骨性融合的相关研究报道较少。
目的：分离培养髓核细胞与骨膜细胞，观察特定环境下髓核细胞的成骨潜能，以及加入骨膜细胞与其共培养后的成骨能力。
方法：Ⅱ型胶原酶消化离心贴壁法分离兔髓核细胞；组织贴壁培养法分离兔骨膜细胞。采用细胞表面抗原CD90、CD105免疫荧光染色法鉴定骨膜细胞，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学鉴定髓核细胞。实验分为两组：成骨诱导环境单独培养的髓核细胞为对照组，加入骨膜细胞与髓核细胞共培养为实验组。CCK8法检测细胞增殖，分别行碱性磷酸酶、茜素红染色、Ⅰ型胶原免疫组织化学染色进行成骨鉴定，Western blot检测两组细胞成骨诱导后骨桥蛋白的表达。
结果与结论：骨膜细胞表面抗原CD90、CD105呈阳性，髓核细胞甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性；1，3，5，7，9 d各时间点实验组髓核细胞增殖活性显著高于对照组；诱导2周后2组细胞碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色均为阳性，但实验组阳性表达高于对照组(P<0.05)；实验组骨桥蛋白表达强于对照组。髓核细胞具有成骨分化的潜能，但体外的增殖能力较低，加入骨膜细胞后，共培养细胞增殖分化能力提高。成骨诱导下骨膜细胞与髓核细胞共培养具有良好相容性，细胞相互黏附，并具有强于单独诱导髓核细胞的成骨能力。 -
正常与退变髓核细胞形态学及Ⅱ型胶原蛋白的定量分析
背景：椎间盘退变导致椎间隙狭窄的主要变化是髓核细胞表达软骨特异性基因产物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的减少。
目的：对成人的正常与退变椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色及番红O染色进行定量观察比较。
方法：取成人脊柱侧弯患者与椎间盘突出症患者自愿者术中取出的废弃髓核组织各3例，经培养后每个患者各测量26个细胞，正常组和退变组分别测量78个细胞。对正常与退变椎间盘髓核细胞进行番红“O”染色并行灰度及测定细胞内Ⅱ型胶原蛋白行免疫荧光染色定量测定。
结果与结论：免疫荧光染色显示：退变椎间盘髓核细胞仅轻度染色，染色模糊，其呈类圆形，纺锤形，梭形及不规则形，其内仅有极少量荧光颗粒；Ⅱ型胶原表达较正常髓核细胞降低显著(P<0.05)。番红O染色显示：退变的髓核细胞肿胀，细胞核肿胀染色略淡，细胞突起延长，胞浆染色不匀伴有空泡，部分细胞崩解，细胞分布零散，混乱，可见成片坏死区。与正常髓核细胞图像灰度值相比差异无显著性意义(P>0.05)。结果表明退变的椎间盘髓核细胞减少、部分凋亡，其细胞内Ⅱ型胶原蛋白含量较正常髓核细胞显著减少。 -
构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体
背景：抑制椎间盘细胞的凋亡可以延缓椎间盘的退变，而生存素具有调节细胞增殖和抗凋亡功能。
目的：构建人生存素基因的慢病毒载体。方法：应用全基因合成技术合成人生存素基因(BIRC5)，通过 PCR扩增目的基因并对 PCR 结果进行电泳分析。将目的基因克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒 Lenti-BIRC5。将重组的慢病毒质粒转化细菌感受态细胞，PCR鉴定阳性的克隆进行基因测序。将含有目的基因的慢病毒质粒转染293T细胞，应用Western blot技术对重组慢病毒载体 Flag-Survivin 融合蛋白的表达进行检测。
结果与结论：PCR鉴定及基因测序结果显示成功构建了含有人Survivin基因的慢病毒表达载体，Western blot检测结果显示目的基因在体外培养细胞中转染成功并且过表达。说明慢病毒表达载体Lenti-BIRC5构建成功，这为下一步研究Survivin在人髓核细胞中的抗凋亡作用提供了载体。 -
人基质金属蛋白酶3基因RNA慢病毒载体构建及在人退变髓核细胞中的鉴定
背景：抑制椎间盘细胞外基质的降解可以延缓椎间盘退变的进程，基质金属蛋白酶3是降解Ⅱ型胶原和蛋白多糖细胞外基质成分的关键酶。
目的：构建人基质金属蛋白酶3特异性shRNA 重组慢病毒载体，感染人退变的髓核细胞，鉴定干扰效果。
方法：根据基质金属蛋白酶3基因mRNA序列，设计4组靶向基质金属蛋白酶3基因的短发夹RNA序列，合成、退火形成双链DNA片段，与经过DNA内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞，对长出的克隆进行菌落 PCR 鉴定，并对阳性克隆进行测序及比对分析。通过转染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。用慢病毒质粒载体感染人退变的髓核细胞，荧光显微镜观察感染率，在72和96 h使用实时PCR和Western blot检测干扰效果。
结果与结论：①酶切和测序两种方法结果证明4种质粒载体的插入序列完全正确，慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为(1-5)×108TU/mL。②含有GCC AGG CTT TCC CAA GCA AAT干扰序列的干扰效率高，72和96 h基质金属蛋白酶3基因表达水平干扰分别为98%和72%，96 h基质金属蛋白酶3蛋白水平干扰57.2%。③实验成功构建了靶向人基质金属蛋白酶3基因RNA干扰慢病毒载体，为进一步研究基质金属蛋白酶3功能和用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。 -
腰突颗粒对人髓核细胞核因子κB信号通路的影响
背景：核因子κB在退变椎间盘中呈高表达，经验方腰突颗粒治疗腰椎间盘突出症临床效果良好，通过核因子κB信号通路试探讨其治疗作用的机制。目的：探讨腰突颗粒含药血清对人髓核细胞核因子κB信号转导通路的影响。方法：将8只新西兰大白兔随机等分为生理盐水组和低、中、高剂量组，分别以生理盐水及10，20，40 mL腰突颗粒水煎剂灌胃7 d。于后一次灌胃2 h后颈总动脉采血，收集血清，分别配成体积分数10%含药血清的DMEM培养液保存备用，分别干预人髓核细胞24 h。结果与结论：体积分数10%含药血清干预后，与生理盐水组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组人髓核细胞中白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、p-P65、P50、IκB-α和IKK-βmRNA相对表达水平均降低，且细胞中p-P65、P50、IκB-α和IKK-β蛋白表达水平降低，同时随着灌服腰突颗粒剂量的增加，白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、p-P65、P50、IκB-α和IKK-βmRNA相对表达水平逐渐降低，p-P65、P50、IκB-α和IKK-β蛋白表达水平降低。提示腰突颗粒含药血清能阻断人髓核细胞中核因子κB信号转导通路，进而减缓髓核细胞的退变，起到保护人髓核细胞的作用。
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胰酶联合Ⅱ型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择
背景：椎间盘退变是脊柱退行性疾病的发病基础，研究椎间盘的退变因素，对脊柱退行性的疾病的预防和治疗有重要意义。
目的：采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法体外分离培养兔髓核细胞，并观察髓核细胞在不同葡萄糖浓度培养基中的生长及增殖状况，确立适宜髓核细胞生长的葡萄糖浓度。
方法：胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养兔髓核细胞，倒置显微镜观察细胞形态并计数细胞数量，绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色观察细胞形态。细胞免疫组织化学染色结合免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白表达情况。分别使用0，6.25，12.5，17.5，25 mmol/L葡萄糖培养基培养髓核细胞24 h后，检测各组髓核细胞增殖及凋亡情况。
结果与结论：①髓核细胞形态：兔髓核细胞染色后镜下观察呈多角形、短梭形，有一两个核仁，随着传代次数增加，细胞伸出伪足，胞体逐渐变细长；②基因表达：体外分离培养髓核细胞的Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白多糖基因均可稳定表达；③细胞增殖：各组中细胞增殖比率以葡萄糖17.5 mmol/L组高，显著高于葡萄糖0，25 mmol/L组(P<0.05或P<0.01)；④细胞凋亡：葡萄糖0 mmol/L组细胞凋亡率高(P<0.05)，其他各组差异无显著性意义(P>0.05)。④结果证实：胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法可收获较多的原代髓核细胞，葡萄糖浓度17.5 mmol/L比较适宜髓核细胞体外培养。 -
五种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对髓核细胞的毒性分析
背景：冻存椎间盘可为同种异体椎间盘移植创造条件，传统的低温冷冻法常导致细胞内外冰晶形成从而造成细胞损伤，玻璃化冻存法可避免冻存过程中细胞内外形成冰晶而得到广泛应用，然而玻璃化法冻存椎间盘在内外文献中却少见报道，冻存试剂对髓核细胞的毒性研究也比较少见。
目的：分析5种玻璃化冻存试剂单独或组合应用对于兔髓核细胞的毒性作用，从而为玻璃化冻存椎间盘选择合适的冻存试剂。
方法：选取目前常用的5种玻璃化冻存试剂：二甲基亚砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，采用单一5种、任意2种及任意3种玻璃化冻存试剂互相组合成各10种冻存试剂组合共25种。用CCK-8和FDA/PI两种方法检测髓核细胞的细胞存活率。用统计学方法对所得数据进行统计分析，选出对髓核细胞毒性较小的玻璃化冻存试剂组合方案。
结果与结论：①两种检测方法检测结果：5种玻璃化试剂对髓核细胞的毒性由小到大依次为：乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亚砜、丙二醇。②2种冻存试剂组合和3种冻存试剂组合的毒性均比组成该组合溶液的任意一种单一玻璃化冻存试剂小。③组合试剂中，含有乙二醇或丙三醇的2种冻存试剂组合或3种冻存试剂组合毒性均较小。故玻璃化冻存椎间盘可选用包含乙二醇和(或)丙三醇的玻璃化组合试剂。 -
SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化
背景:移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应.目的:探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果.方法:提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组.转染后第14 天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的mRNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达.结果与结论:共转染组SOX-9 mRNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P < 0.05);共转染组GDF-5 mRNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05).共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05).SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染.
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一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂对髓核细胞线粒体功能的影响
背景：一氧化氮可通过诱发炎性细胞因子的释放，进而干扰细胞线粒体功能，加速椎间盘损伤及退变，是压力等外界因子导致椎间盘退变的重要炎性细胞递质。
目的：分析一氧化氮及一氧化氮合酶抑制剂烟酰胺对兔髓核细胞线粒体功能的影响及其与髓核细胞生物学行为的相关性。
方法：将体外培养的兔腰椎间盘髓核细胞分为6组，正常空白对照组、10μmol/L 硝普钠组、100μmol/L硝普钠组、200μmol/L硝普钠组、0.05 g/L烟酰胺组(100μmol/L硝普钠+0.05 g/L烟酰胺)、0.5 g/L烟酰胺组(加入100μmol/L硝普钠和0.5 g/L烟酰胺干预)，向各组培养基内加入不同剂量的一氧化氮供体硝普钠及烟酰胺进行干预。干预3 d后检测髓核细胞增殖活力、细胞内ATP浓度、细胞内活性氧水平、细胞内一氧化氮合酶活性以及髓核细胞线粒体膜电位。
结果与结论：①兔髓核细胞经不同浓度的硝普钠干预3d后，细胞内一氧化氮合酶量随硝普钠浓度加大而增加、ATP浓度则随着减小，与正常对照组比较差异有显著性意义(P<0.01)；②硝普钠组可提高髓核细胞内活性氧水平,烟酰胺组呈剂量依赖性改善因硝普钠干预下的细胞内活性氧水平(P<0.01)；③硝普钠组可引起髓核细胞膜电位下降，烟酰胺组可减轻因硝普钠引起的膜电位下降(P<0.01)；④与硝普钠组比较烟酰胺组也呈剂量依赖性促进髓核细胞增殖(P<0.01)及改善髓核细胞的增殖活力，2组之间差异有显著性意义(P<0.01)；⑤结果说明，过量一氧化氮可损伤兔髓核细胞线粒体功能而导致细胞能量代谢障碍，烟酰胺能够通过抑制一氧化氮的合成以及保护椎间盘细胞线粒体功能和改善细胞能量代谢，有助于预防椎间盘退变。 -
髓核细胞凋亡调控中的MicroRNA-182
背景：前期从中发现hsa-miR-182可能与髓核细胞中凋亡相关基因细胞色素C(cytochrome C，Cycs)基因及钙调磷酸酶(calcineurin)的C亚基CnB(PPP3R1)基因有密切联系。
目的：以质粒为载体，将miR-182及细胞色素C和PPP3R1基因转染进髓核细胞系，检测细胞系中凋亡相关基因细胞色素C及PPP3R1的表达量，明确miR-182是否参与髓核细胞凋亡的调控。
方法：miR-182进行生物信息学预测，将其与预测得到的目标基因进行质粒合成并转染髓核细胞，并建立空白对照，后进行细胞裂解检测目标基因表达情况。
结果与结论：①经检测，miR-182较空白对照组髓核细胞对细胞色素C基因的表达有明显的抑制作用(P<0.05)；②与空白对照组比较，miR-182对于PPP3R1基因的表达无抑制作用。③结果表明，miR-182对于髓核细胞凋亡相关基因细胞色素C有明显抑制作用，可能参与髓核细胞凋亡的调控。 -
MicroRNAs在缺氧诱导因子1α缺失椎间盘组织中的差异性表达
背景：MicroRNAs在椎间盘退变的疾病中起重要作用，缺氧诱导因子缺失可加速椎间盘的退变。
目的：检测缺氧诱导因子1α后小鼠椎间盘内microRNAs的变化情况，探究microRNAs与椎间盘退变的关系及缺氧诱导因子1α调控椎间盘退变机制和通路。
方法：通过前期构建的条件性敲除髓核细胞缺氧诱导因子1α基因的小鼠，分别取基因敲除组与正常对照组4周龄小鼠的椎间盘组织进行组织学染色观察；通过提取标本的总RNAs，从中分离microRNAs，荧光标记后与微阵列芯片杂交，扫描检测后数据经分析处理，筛选椎间盘组织中microRNA差异表达谱。采用实时荧光定量RT-PCR技术验证在椎间盘组织中均存在显著差异表达的microRNAs。分析差异表达microRNAs的靶基因及通路，预测其在椎间盘退变中的作用。
结果与结论：缺氧诱导因子1α基因缺失小鼠椎间盘髓核细胞数量减少，细胞形态变小，细胞质着色加深；两组小鼠椎间盘中的microRNAs的芯片筛选结果中，10个microRNAs发生了明显的差异表达，其中有7个microRNAs发生上调，3个microRNAs发生下调。结果提示缺氧诱导因子1α缺失后可能引起某些重要的microRNAs调节失衡，引起椎间盘髓核细胞大量的死亡，加速椎间盘的退变。 -
差速贴壁法原代培养椎间盘髓核细胞中的应用优势
背景：髓核细胞作为椎间盘的主要功能细胞是退变机制研究的重点对象，维持体外培养的髓核细胞的生理功能及细胞表型的稳定至关重要。
目的：通过对照研究差速贴壁法在大鼠椎间盘髓核细胞原代培养中的应用优势。
方法：取4周龄雄性Wistar大鼠20只，体外分离培养椎间盘髓核细胞，待原代细胞汇合近90%时进行分组传代，差速贴壁组在传代细胞贴壁30 min时，将未贴壁细胞吸出重新调整浓度后传至新的培养皿中，对照组不作处理。差速贴壁组第1、2代细胞均采用该法分离纯化。对两组第3代细胞进行细胞形态学比较及免疫组化鉴定纯度分析、CCK-8检测细胞功能活性并绘制细胞生长曲线。
结果与结论：①倒置显微镜观察及苏木精-伊红染色，差速贴壁组细胞均一性较对照组明显增高，对照组髓核细胞中混有较多的成纤维样细胞；②Ⅱ型胶原免疫组化鉴定及纯度分析，2组细胞胞浆均为被染成黄褐色，证实为髓核类软骨细胞；③纯度分析差速贴壁组阳性率显著高于对照组(P<0.05)；④CCK-8细胞生长曲线显示，2组细胞均经过2 d的生长潜伏期，3 d的指数生长期，进入生长停滞期，而对照组较差速贴壁组在潜伏期和指数增长期的早期生长更迅速。⑤结果说明，差速贴壁法是原代培养大鼠髓核细胞一种实用、有效的分离纯化方法；原代培养、经2次差速贴壁法分离纯化的第3代大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致，细胞纯度更高，其对数增长期可以作为椎间盘细胞机制研究的佳时期。 -
基于RNA-seq技术分析腰突颗粒防治腰椎间盘退变的转录组学特征
背景:腰突颗粒是课题组治疗腰椎间盘退行性疾病的经验方,一直有较好的临床疗效,但其作用机制一直未明确.目的:基于转录组测序(RNA-Seq)技术探讨临床经验方腰突颗粒防治腰椎间盘退变的可能分子机制.方法:将10只新西兰大白兔按随机数字表随机分为生理盐水组和腰突颗粒组(n=5),生理盐水组予以生理盐水20 mL/次灌胃,腰突颗粒组予以灌服腰突颗粒水煎剂20 mL/次,均2次/d,连续灌胃1周.于后一次灌胃完成2 h后经颈总动脉采血收集兔血清分别制作为10%DMEM培养液;分别使用2种血清培养液培养人髓核细胞,镜下观察2组细胞形态,锥虫蓝染色后测定2组细胞活力;另取第3代髓核细胞,干预48 h后采用RNA-Seq技术对2组细胞中的mRNA进行检测,进行转录组测序筛选差异mRNA;将得到测序结果进行差异基因表达、GO功能显著性富集及Pathway显著性富集分析.结果与结论:①腰突颗粒组髓核细胞贴壁后以圆形或梭形多见,胞浆充足,胞核清晰.细胞核核表面光滑,核膜完整,长条状粗面内质网排列整齐,线粒体少,胞质内可见散在溶酶体及纤丝;生理盐水组细胞呈梭形和多角形,细胞核大,核仁多为2或3个,细胞核表面稍粗糙且质网可见轻微扩张,线粒体少且有部分膜不完整;②腰突颗粒组髓核P1、P2、P3代细胞贴壁速度、传代时间及细胞活力均优于生理盐水组(P<0.05);③比较2组测序结果发现,差异表达基因共有464个,其中上调基因有143个,下调基因有321个.差异基因的GO功能显著性富集分析显示,差异基因主要集中在生物过程部分的细胞调控与代谢过程中.差异基因的Pathway显著性富集分析结果发现,主要集中在代谢相关通路;④综上,通过RNA-Seq技术获得了腰突颗粒防治椎间盘退变作用的差异基因表达谱,腰突颗粒防治椎间盘退变的分子机制主要通过调节上调细胞外基质代谢相关基因及下调多糖合成相关基因实现,可为进一步研究提供基础.
