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软骨脱细胞细胞外基质多孔支架与山羊髓核细胞生物相容性研究
目的 制备软骨脱细胞细胞外基质多孔支架,并探讨其与山羊髓核细胞的生物相容性.方法 猪关节软骨经研磨、脱细胞、冷冻干燥技术等处理制成三维多孔支架；从山羊腰椎间盘中分离出髓核细胞,培养后获取P1代细胞；四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测支架浸提液毒性；将髓核细胞以5×106/ml的密度接种在支架上体外培养48 h,通过倒置显微镜、HE染色、死活细胞染色(LIVE/DEAD染色)、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附及活性.结果 软骨脱细胞基质多孔支架在敷水状态下光滑透明,分离的髓核细胞呈典型的软骨细胞样形态；MTT检测各组间增殖,其差异不具有统计学意义(P＞0.05)；倒置显微镜、电镜观察髓核细胞呈球状或短梭形均匀地贴附在支架内部,HE染色观察可见髓核细胞均匀分布在支架内部,LIVE/DEAD染色显示全部为绿色荧光(活细胞),未见红色荧光(死细胞).结论 软骨脱细胞基质多孔支架在组成上与髓核组织相似,与山羊髓核细胞具有良好的生物相容性,可以作为髓核组织工程的支架材料.
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体外培养人退变髓核与纤维环细胞增殖能力的研究
目的 探讨体外培养的人退变髓核与纤维环细胞的增殖能力,比较2种退变细胞体外培养中所表现的不同生物学行为,为椎间盘退变疾病的预防与治疗提供新的理论依据.方法 采集临床腰椎间盘突出症患者手术取材的椎间盘组织标本,病理学诊断评估其退变程度,酶消化法原代培养髓核与纤维环细胞,并鉴定.每例病例的髓核细胞与纤维环细胞分别体外培养至第5代,各代次细胞传代接种密度控制为1×105个.同条件培养48 h后,观察每一代细胞的形态学变化,同时应用流式细胞仪检测2种细胞的增殖能力.结果 体外培养的退变髓核与纤维环细胞生长状态良好.随着体外传代的进行,退变髓核与纤维环细胞S期细胞百分比和增殖指数(PI)均呈上升趋势,髓核细胞PI值于第3代时达到峰值,而纤维环细胞PI值于第5代时高；且第2～4代的退变髓核细胞的增殖活性均高于退变纤维环的增殖活性(P＜0.05).结论 体外培养的人退变髓核与纤维环细胞有着不同的增殖特点,髓核与纤维环细胞对体内退变微环境有着不同的响应机制,并影响着整个椎间盘退变的进展.
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牵张微应变对人退变髓核与纤维环细胞增殖的影响
目的:探讨循环牵张微应变对体外培养的人退变髓核与纤维环细胞增殖的影响.方法:人退变椎间盘组织来源于1例29岁腰椎间盘突出症患者的手术取材,病理学诊断评估其退变程度,无菌条件下酶消化法分别原代培养髓核与纤维环细胞,并对细胞系进行鉴定.将第3代细胞接种于硅橡胶膜载体上,利用EF3200力学试验仪搭载的BioDynamic生物反应舱系统,对其施加频率为0.25 Hz,应变为0με、5万με、10万με和15万με的加载3h,应用流式细胞仪检测不同微应变环境下2种细胞的增殖活性.结果:退变髓核与纤维环细胞应力加载后生长状态良好.随着微应变的增加,髓核细胞S期细胞比例在10万με、15万με时均高于纤维环细胞,差异有统计学意义(P＜0.01)；纤维环细胞增殖指数(PI)在各微应变加载组均高于髓核细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:微应变刺激对人退变髓核与纤维环细胞的增殖总体效应是一致的,但相同的微应变刺激对纤维环细胞增殖的促进效应明显高于髓核细胞.
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PKH26荧光标记牛尾髓核细胞的实验研究
目的：探讨PKH26荧光标记在牛尾髓核细胞的应用，为髓核组织工程的体内研究提供可示踪的种子细胞。方法从牛尾椎间盘中分离髓核组织，通过酶消化法获取原代细胞，倒置显微镜下观察，P1代髓核细胞进行番红O、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色，对P1代髓核细胞进行PKH26荧光染料标记，并对标记后细胞的活性、荧光强度（0、14、28 d）、增殖特性及基因表达进行评估。结果分离得到的髓核细胞数为（1.56±0.35）×106/g，倒置显微镜下，原代细胞培养4 d开始贴壁，细胞成群生长，14 d铺满瓶底，原代细胞、P1代细胞均呈类软骨样细胞形态；P1代髓核细胞甲苯胺蓝染色异染、番红O染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性；PKH26标记前后细胞活性均在95%以上，1、14、28 d呈递减趋势，但28 d时细胞仍可检测出较强的荧光，标记后的细胞增殖及基因表达（Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖）与标记前的细胞相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论牛尾髓核组织中可以分离出数量满意的髓核细胞，且具有软骨样细胞的表型，可以用作种子细胞；PKH26标记后的髓核细胞无生物学特性的变化，可以用作髓核细胞体内研究的示踪染料。
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髓核细胞及其生物力学研究进展
随着社会的老龄化进程,退行性疾病的发病率有所上升,腰椎间盘突出症在成人中的发生率较高,主要原因是椎间盘退变.首先纤维环、髓核细胞逐渐衰老、凋亡,并导致细胞结构改变和细胞外基质成分减少.对髓核细胞力学特性的研究可阐明力学因素在髓核蜕变发病过程中的机制,同样也为髓核组织工程中相关力学因素的研究提供新的思路,为利用组织工程治疗椎间盘退变提供相关实验依据.
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TNF-α诱导大鼠髓核细胞凋亡过程中EMP-1和Caspase-3基因表达及意义
目的:研究肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)对髓核细胞作用的剂量和时间依赖关系;观察TNF-α诱导体外培养大鼠髓核细胞凋亡过程中上皮膜蛋白1(Epithelial Membrane Protein 1,EMP-1)、半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3,Caspase-3)基因表达变化.方法:分离并消化SD大鼠椎间盘组织得到单个髓核细胞.构建凋亡细胞模型,免疫组织化学法检测各组EMP-1表达随浓度变化规律;RT-PCR检测EMP-1、Caspase-3 mRNA表达量.结果:凋亡细胞模型组中,实验组较对照组EMP-1表达明显增高.TNF-α浓度为500 ng/mL时诱导凋亡为明显,且EMP-1、Caspase-3 mRNA表达量明显增高,差异有统计学意义,作用12 h时高.结论:TNF-α能够诱导髓核细胞凋亡并且与剂量和时间相关性;TNF-α作用髓核细胞能够促进EMP-1、Caspase-3 mRNA的表达增高,炎症因子是导致EMP-1表达增高原因之一.
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高渗培养基对椎间盘内髓核细胞活力及代谢的影响
目的 探讨高渗培养基对椎间盘内髓核组织及髓核细胞活力的影响. 方法 6-7周龄SD大鼠10只,无菌取每只大鼠胸腰段椎间盘9个,置于高渗(410 mOsm/kg)培养基中整体培养,培养前及培养第7,14,21,28天,利用Mitotracker Green荧光探针、免疫组织化学和生物化学方法检测细胞的活力、椎间盘结构的变化以及髓核组织细胞外基质成分的变化. 结果 椎间盘组织形态、细胞存活率及髓核细胞外基质成分与新鲜离体椎间盘无统计学差异.髓核细胞存活率荧光强度检测提示培养后第21天与培养前比较荧光强度明显降低(7 782±367vs10 435±376,P＜0.05).髓核组织内蛋白多糖含量(mg/100ms)检测提示培养第21天与培养前相比明显降低(3.72±0.45 vs 6.35±0.76,P＜0.05). 结论 在高渗培养基中(410mOsm/kg),髓核细胞可以良好存活至少14 d,大鼠髓核组织内蛋白多糖可以有效保持14 d.
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身痛逐瘀汤对大鼠腰椎间盘髓核细胞凋亡相关因子的作用
[目的]研究身痛逐瘀汤药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1表达的影响.[方法]用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析身痛逐瘀汤药理血清对诱导凋亡大鼠腰椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1表达的影响.[结果]身痛逐瘀汤组和凋亡诱导组比较,TGF-β1明显下降,而Sox9明显上升,差异有统计学意义(P＜0.01).[结论]身痛逐瘀汤可以调控大鼠椎间盘髓核细胞内TGF-β1、Sox9表达,其延缓椎间盘退变的机制可能与调控细胞的凋亡相关因子有关.
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不同程度低氧诱导因子-1α表达对SD大鼠髓核细胞凋亡的影响
目的 探讨培养的髓核细胞中低氧诱导因子(HIF-1α)表达程度的不同与细胞凋亡之间的关系,进而探讨低氧诱导因子与间盘退变的关系.方法 1取30日龄SD大鼠髓核进行原代培养,将传代得到的细胞分为4组施加处理因素:正常氧条件组;低氧条件组;低氧条件并经CoCl2诱导组(HIF-1α高表达组);正常氧条件并经Genistein处理组(HIF-1 α表达受抑制).各组在各自条件下培养24h,运用western-blot检测各组低氧诱导因子表达量,通过流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡情况,运用SPSS 11.5软件对实验结果进行相关分析.结果 氧浓度越低,髓核细胞低氧诱导因子表达的量越多,髓核细胞凋亡率越高.正常氧条件并经Genistein处理后,髓核细胞凋亡率较HIF-1α高表达组显著降低(P＜0.05).结论 HIF-1α高表达可以诱导髓核细胞凋亡,过度的低氧刺激是间盘退变的一个重要诱因.
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三维共培养免髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞分化
背景:在椎间盘组织工程研究领域,种子细胞主要有髓核细胞与骨髓间充质干细胞.髓核细胞来源有限,取材不便,增殖能力差,体外培养困难.目的:利用海藻酸盐微球模拟的三维环境下,将兔髓核细胞与骨髓间充质干细胞共培养,观察骨髓间充质干细胞的分化情况.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料;4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,应用Ⅱ型胶原酶消化法及贴壁法分离培养兔椎间盘髓核细胞.取传至第3代骨髓间充质干细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选后,分为2组:单独培养组将转染后的骨髓间充质干细胞单独培养,共培养组将其与髓核细胞按1:1比例于海藻酸盐凝胶微球中进行共培养.共培养14 d后,溶解海藻酸盐凝胶珠,通过流式分选收集骨髓间充质干细胞.主要观察指标:利用RT-PCR法和Westernblot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达.结果:共培养14 d后,共培养组有Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA及蛋白的表达,而单独培养组均呈阴性表达.结论:通过三维共培养,兔椎间盘髓核细胞能够在体外诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞方向分化.
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静水压对人椎间盘髓核细胞形态及基质表达的影响
背景:加载在椎间盘上的重力引起的静态压力刺激是椎间盘细胞代谢的重要调节因素.目的:观察静水压对体外单层培养人椎间盘髓核细胞形态学及基质代谢的影响.方法:在静水压加载系统中对体外单层培养的传4 代人髓核细胞施以0.3,0.7,3 MPa 的静压,分别加压30,60,90,120 min,以常压0.1 MPa 为对照.结果与结论:①髓核细胞形态:在静水压干预下细胞体积均变小.0.3,0.7 MPa 静水压下轻微缩小,细胞形态相对完整;3 MPa 静水压下缩小明显,且细胞形态不完整.②髓核细胞存活率:在持续静水压刺激下开始的30 min,不论压力大小存活率都偏低,在0.3,0.7 MPa 时随作用时间延长而增加或维持稳定,细胞增殖逐渐增强,在3 MPa 时随时间趋于下降,终细胞总体数量减少.③髓核细胞蛋白多糖:各组表达量随时间增加逐渐增加,当持续加压120 min 时,在0.3,0.7 MPa静水压下合成量呈高表达状态,在0.1,3 MPa 静压表达相对较少.表明静水压会对髓核细胞形态学、存活率及基质表达产生影响.
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藻酸钠微球介导髓核细胞对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响
背景:椎间盘退行性变的理想治疗方法是利用组织工程技术修复退行性变的椎间盘,而修复所需的髓核细胞来源十分有限.目的:观察在藻酸盐微球的介导下,髓核细胞与骨髓间充质十细胞非接触共培养时,髓核细胞对骨髓间充质干细胞的诱导作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,实验于2007-10/2008-08在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和中心实验室进行.材料:4月龄健康新两兰大耳白兔5只,取髓核细胞与骨髓间充质干细胞原代培养,利用传代法分离纯化.方法:①将纯化的骨髓间充质干细胞经胰蛋白酶消化、收集,并与适量的藻酸钠溶液混合,形成109 L-1的单细胞悬液,将混合好的单细胞悬液经注射器滴加至35 g/L的CaCl2溶液中,形成海藻酸钙凝胶珠.②将海藻酸钠凝胶微球与髓核细胞共培养.在7 d和15 d时,分组溶解海藻酸钙凝胶珠.收集骨髓间充质干细胞.主要观察指标:利用免疫组化技术、RT-PCR技术和Western blot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达,用以判断髓核细胞对骨髓间充质干细胞在非接触条件下的诱导作用.结果:在骨髓间充质干细胞的细胞爬片免疫组化染色中可见,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖染色阳性,RT-PCR和Western blot 结果显示经诱导后骨髓间充质干细胞中已有Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖基因的表达,且诱导15 d组的目的条带明显亮于诱导7 d组的目的条带.结论:在藻酸盐微球的介导下,体外非接触共同培养时髓核细胞能够实现对骨髓间充质干细胞的诱导作用.
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氧化应激对大鼠髓核细胞凋亡的影响
背景:细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素.目的:从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓饮细胞氧化应激损伤的影响.设计、时间及地点:单一样本观察.试验于2008 03/10在山东省创伤骨科研究所完成.材料:p38MAPK特异性阻断刺(SB203580)、JNK特异性阻断剂(SP600125)购自碧云天生物技术有限公司:大鼠椎间盘来自2只新生24 h SD大鼠.方法:原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组:H202组:用0,50.100,200,400,800μmol/L H2O2刺激:对照组:不加刺激的细胞:SB203580+H2O2组:给予特异性p38MAPK阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激:SP600125+H2O2组:给予特异性JNK阻断剂SP600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激.上述处理后检测相关指标.主要观察指标:以免疫组织化学检测P-p38和P-JNK的表达情况及表达位置:Western印迹法检测SAPKJJNK、p38MAPK及其磷酸化组分的表达.结果:H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性:SB203580能够有效地抑制p38MAPK的活性,而SP600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示P-p38MAPK和P-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现.结论:大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38MAPK和JNK通路导致细胞凋亡.
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重组人骨形态发生蛋白7腺病毒载体构建及在原代培养兔髓核细胞中的表达
目的:研究表明,外源性重组骨形态发生蛋白7具有促进椎间盘细胞增殖以及促进细胞外基质合成的能力,为探讨骨形态发生蛋白7基因疗法治疗椎间盘退变的可行性,本实验拟构建重组人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体,并观察其在原代培养的兔椎间盘髓核细胞中的表达情况.方法:实验于2005-12/2006-06在长海医院胸心外科研究所完成.从整合有人骨形态发生蛋白7全长cDNA的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-骨形态发生蛋白7中聚合酶链反应扩增骨形态发生蛋向7基因的开放读码框,通过穿梭质粒整合到腺病毒载体pAd-Easy系统上,在293细胞中包装成熟、扩增,酶切鉴定人骨形态发生蛋白7基因整合到该载体中;该载体转染原代培养的兔髓核细胞,并采用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹的方法检测其表达情况.结果:①实验成功建立了安全、稳定、有效的复制缺陷重组腺病毒Ad-骨形态发生蛋白7的构建方法,经鉴定后证实有骨形态发生蛋白7全长cDNA整合,并且为正向插入.②体外培养的兔原代髓核细胞表现出代谢活性低、增殖能力弱等特点;髓核细胞能够被腺病毒载体高效感染并能够高效表达不同的目的基因,感染效率随感染倍数值的增加而增加;当感染倍数=100时,95%以上的髓核细胞可以被感染,且细胞毒性较小,为佳感染倍数.③采用佳感染倍数转染髓核细胞后骨形态发生蛋白7基因在转染后3 d就开始表达,并可以持续表达3周以上,几乎所有髓核细胞都可以表达骨形态发生蛋白7.结论:腺病毒载体可以作为进行骨形态发生蚩白7基因治疗椎间盘退变研究的有效载体.
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共同培养骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响
目的:针对椎间盘退行性变的组织修复目前集中于细胞移植治疗,实验在体外联合培养条件下观察骨髓基质干细胞对髓核细胞增殖分化的影响.方法:实验于2005-12/2006-09在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院卫生部重点实验室进行.①实验方法:4月龄健康新西兰大耳白兔3只,麻醉后于髂嵴处作骨髓腔穿刺,抽吸6 mL骨髓,分离骨髓基质干细胞;相同实验兔抽取骨髓后立即处死,取腰骶部脊柱之椎间盘,切开纤维环,取出髓核组织,分离椎间盘髓核细胞,同时设立单独髓核细胞培噜养组.②实验评估:在相同的培养条件下,定期观察两组髓核细胞在光镜下形态学变化及电镜下细胞超微结构的改变;于诱导培养7,14 d通过RT-PCR法、Western blot法和免疫组化法法检测两组髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达.结果:(①髓核细胞大体形态学及超微结构变化:髓核细胞与骨髓基质干细胞共同培养后,髓核细胞很快就呈现为圆形或多角形,且细胞形体变大、折光性好,贴壁时间早,数量增殖快,超微结构细胞表面可见许多短而粗的微绒毛突起,胞质内有大量扩张的粗面内质网、丰富的线粒体和高尔基体,细胞合成代谢旺盛.单独培养的髓核细胞胞体小,贴壁、增殖慢,细胞器不丰富.②髓核细胞Ⅱ型胶原蛋白与聚集蛋白聚糖检测结果:RT-PCR和Western blot检测显示诱导培养7,14 d骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组的Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖条带均明显亮于单独髓核细胞培养组,吸光度值比较差异有显著性意义(P＜0.01).免疫组化检测显示骨髓基质干细胞与髓核细胞共同培养组中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖在细胞胞浆中的表达随时间延长而逐渐增加,2周达到高峰,单独髓核细胞培养组中此两种蛋白表达很低,且培养第7,14天无明显变化.结论:骨髓基质干细胞在体外与髓核细胞共同培养时,能激活髓核细胞并促进其增殖分化,增加髓核细胞外基质的合成.提示骨髓基质干细胞与髓核细胞联合培养有利于退变椎间盘的髓核细胞修复、再生.
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骨髓间充质干细胞与髓核细胞的体外共培养
背景:细胞移植治疗椎间盘退行性变目前尚处在实验室研究阶段.目的:通过SD大鼠骨髓间充质干细胞与退行性改变的髓核细胞体外共培养,探索骨髓间充质干细胞能否通过直接接触促进髓核细胞外基质的表达以及髓核细胞能否诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化.方法:取已自然退变的第6 代髓核细胞与生长良好的第4 代骨髓间充质干细胞按不同比例(75∶25,50∶50 和25∶75)体外共培养7 d,单独髓核细胞(100∶0)与单独骨髓间充质干细胞(0∶100)分别作为阳性对照和阴性对照.结果与结论:RT-PCR 检测显示共培养组(75∶25 和50∶50)蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白条带均明显亮于单独髓核细胞培养组(100∶0),吸光度值比较差异有显著性意义;免疫组织化学检测显示Ⅱ型胶原蛋白在共培养组(75∶25 和50∶50)胞浆内的表达明显高于单独髓核细胞培养组(100∶0).共培养组中可见骨髓间充质干细胞由长梭形向多角形、类圆形转变,胞浆内异染颗粒增多.提示通过体外直接接触共培养,骨髓间充质干细胞能逆转髓核细胞退变,而且髓核细胞能诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞转换.
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体外培养人退变髓核细胞的生物学性状
背景:椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础.目的:观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性.方法:分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达.ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平.结果与结论:体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变.对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势.
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新式分层共培养环境下人骨髓间充质干细胞诱导髓核细胞的分化
背景:诱导分化的骨髓间充质干细胞或髓核细胞移植都存在一定的局限性,抑制自体髓核细胞的退行性变有望成为未来治疗椎间盘退变的有效方法.目的:通过建立骨髓间充质干细胞和髓核细胞分层共培养模型,观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞分化的影响.方法:取传至第4代的骨髓间充质干细胞,分为2组:新式分层培养组将髓核细胞接种于去掉挂臂的Transwell小室,膜孔0.4 μm,其与骨髓间充质干细胞比例为1∶1;传统分层培养组同法将髓核细胞接种于带有挂臂的Transwell小室.同时设立单独髓核细胞培养组,各组均培养7 d.免疫组织化学法检测Ⅱ型胶原的表达,~(35)S放射标记渗入放免定量检测蛋白多糖的合成.结果与结论:与单独髓核细胞培养组比较,传统分层培养组、新式分层培养组Ⅱ型胶原阳性细胞数、蛋白多糖合成量均明显增加(P < 0.05,P < 0.01),且新式分层培养组增高幅度大于传统分层培养组(P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞与髓核细胞接触共培养后,能显著增加髓核细胞分化增殖和特征性物质的表达,且新式分层培养环境优于传统分层培养.
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壳聚糖支架复合重组人成骨蛋白1对体外培养兔髓核和纤维环细胞蛋白聚糖合成的影响
成骨蛋白1有效刺激软骨细胞蛋白聚糖和胶原蛋白合成已被证实,椎问盘内注射成骨蛋白1可增加椎间盘高度也在动物模型中得到证实.目的:体外评价重组人成骨蛋白1对培养于壳聚糖凝胶中的兔椎间盘细胞增殖和蛋向聚精合成的作用.设计、.时间及地点:成组设计,实验于2007-08/2008-02在北京军区总医院骨科实验室完成.材料:清洁级4月龄日本大耳兔5只.重组人成骨蛋白1为Sigma分装.医用级壳聚糖,脱乙酰度95.11%,黏度155 mPa·s.Mr870 000,由北京纵横洋洲医药生物科技有限公司提供.方法:无菌条件下取日本大耳兔椎间盘10个,分离其髓核和纤维环细胞并接种于自制壳聚糖凝胶支架,在培养液中加入重组人成骨蛋白1,并分为3组:对照组(无重组人成骨蚩白1)、100 μg/L重组人成骨蛋白1组、200 μg/L重组人成骨蛋白1组.主要观察指标:培养7,14,21 d时对培养物DNA含量、蛋白聚糖合成量(35SO42-摄入量、硫酸盐黏多糖含量)进行检测.结果:100,200 μg/L重组人成骨蛋白1组的DNA含量没有减少,对照组DNA含量逐渐F降.100,200 μg/L重组人成骨蛋白1组蛋白聚糖合成量明显高于对照组,200 μg/L重组人成骨蛋白1组升高更为显著.100,200 μg/L重组人成骨蛋白1组在3个时间点均呈现上升趋势,培养14 d和21 d的差异有显著性意义(P<0.001).结论:重组人成骨蛋白1可有效促进体外培养的兔髓核和纤维环细胞增殖及蛋白聚糖合成.
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应用流式细胞术测定CD24表达鉴定人髓核细胞
背景:CD24 是成熟髓核细胞表面表达的特异性分子,测定CD24 的表达是否可以作为鉴定髓核细胞的一种方法?目的:验证流式细胞仪测定髓核细胞CD24 表达鉴定髓核细胞的方法.方法:采用酶消化法分离培养人髓核细胞,取生长旺盛的第2 代人髓核细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,RT-PCR测定Ⅱ型胶原及SOX9 的表达,流式细胞仪检测其CD24 阳性表达率,分析来自同一批细胞的免疫组织化学染色、RT-PCR结果与CD24 阳性率的相关性.结果与结论:体外分离培养的7 例第2 代髓核细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,RT-PCR结果阳性,流式细胞仪测定CD24 其阳性率均为50%以上,髓核细胞分泌胞外基质Ⅱ型胶原与SOX9 的表达与CD24 阳性率结果有相关性.提示采用流式细胞仪测定CD24 表达可以快速、简便地鉴定髓核细胞.
