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内质网凋亡途径参与了高糖诱导髓核细胞凋亡的过程
背景:椎间盘退变是下腰痛的主要诱因,髓核细胞的凋亡是椎间盘退变的重要危险因素.然而,椎间盘退变引起下腰痛的具体分子机制目前尚不明确.目的:探讨内质网应激是否参与高糖诱导兔髓核细胞凋亡的过程.方法:将第3代兔髓核细胞随机分为空白对照组(正常培养液);高糖组(培养基中葡萄糖浓度为100 mmol/L);抑制剂组(培养基中含有Caspase-12抑制剂Z-ATAD-FMK);抑制剂+高糖组(培养基中含有Z-ATAD-FMK及100 mmol/L的葡萄糖).分别处理6 h后,检测各组细胞的增殖活性、凋亡率、活性氧自由基、Caspase-12和葡萄糖调节蛋白78的变化情况.结果与结论:①高糖组细胞增殖明显抑制,活性氧自由基、凋亡率、Caspase-12和葡萄糖调节蛋白78表达量较对照组明显增加;②Z-ATAD-FMK可以降低高糖诱导的细胞凋亡率以及Caspase-12和葡萄糖调节蛋白78表达的增加;③结果表明,内质网凋亡通路参与了高糖诱导兔髓核细胞的凋亡过程;高糖诱导的活性氧自由基过量产生及积累是引起内质网应激的主要因素.
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多西环素在纤维连接蛋白诱导髓核细胞退变过程中的作用
背景:多西环素在阻止间盘退变方面有一定的作用,但是其在椎间盘中抑制基质金属蛋白酶的机制并未完全阐明.目的:从分子内信号传导角度采用细胞实验来阐明多西环素抑制间盘内基质金属蛋白酶的作用机制.方法:体外培养人间盘髓核细胞,在培养液中加入相对分子质量为45000纤维连接蛋白片段制造退变模型.在退变模型中按照不同作用时间及不同作用浓度分组,均通过Western blot方法检测各组Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13蛋白的表达情况.然后在10 mg/L多西环素作用24 h后,Western blot方法测定各组ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38、JNK、p-JNK蛋白表达水平,并根据以上实验结果选择ERK及JNK通路抑制后,Western blot检测多西环素对MAPK通路蛋白表达的影响.结果与结论:①纤维连接蛋白可以诱导髓核细胞退变,表现为基质金属蛋白酶13表达增加、Ⅱ型胶原表达降低.多西环素可以抑制纤维连接蛋白诱导的退变髓核细胞基质金属蛋白酶13的表达,但并不呈时间依赖性和剂量依赖性;②多西环素作用于经纤维连接蛋白诱导的髓核细胞后可以抑制其ERK1/2及JNK磷酸化,双重抑制有效地阻断了ERK1/2及JNK在髓核细胞中的激活,与多西环素或MAPK抑制剂单独作用相比,这种联合作用协同地增强了对ERK及JNK磷酸化的抑制作用.因此多西环素可能通过阻断ERK1/2及JNK在髓核细胞中的激活来抑制金属基质蛋白酶表达,进而减少细胞外基质降解,具有预防和治疗间盘退变的潜在作用.
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干细胞治疗椎间盘退变性疾病：现状与展望
背景：目前关于椎间盘退变性疾病的治疗方案均未关注于缓解或逆转椎间盘退变的病程，近年来越来越多的研究正在尝试使用干细胞治疗椎间盘退变性疾病。目的：综述干细胞治疗椎间盘退变性疾病的现状、展望与挑战。方法：由第一作者应用计算机检索PubMed数据库中相关文献，检索时限为2004年1月至2014年12月。检索英文主题词“stem cel，intervertebral disk”。选择文章内容与干细胞治疗椎间盘退变性疾病有关者，同一领域文献则选择近期发表在权威杂志的文章。结果与结论：初检得到文献342篇，选择符合纳入标准的43篇文献进行综述。将干细胞与载体结合后注射到退变的椎间盘是一种全新的治疗方案。目前适用于干细胞疗法的候选细胞包括：胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、人脐带间充质干细胞及类软骨细胞或髓核细胞。未来干细胞疗法的临床应用需克服以下风险：细胞泄露、椎间盘感染及肿瘤化，但其应用于治疗椎间盘退变性疾病的前途将不可估量。
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人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导髓核细胞退变的保护作用
背景:人脐带华通胶间充质干细胞移植到犬退变椎间盘模型中可存活,恢复部分椎间盘高度,但其对炎性损伤后髓核细胞是否有修复治疗作用目前还没有文献报道.目的:观察人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导大鼠髓核细胞退变的保护作用.方法:将第3代SD大鼠髓核细胞分3组培养,对照组用含胎牛血清的培养基培养24 h,然后换完全培养基培养24 h;白细胞介素1β组以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h,然后换完全培养基培养24 h;实验组先以含白细胞介素1β和胎牛血清的培养基培养24 h,再更换完全培养基与人脐带华通胶间充质干细胞非直接共培养24 h.采用Annexin V/PI染色后流式细胞仪测定3组髓核细胞凋亡率,RT-PCR测定各组髓核细胞基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶抑制剂1的表达,caspase试剂盒检测caspase-3、caspase-8和caspase-9活性.结果与结论:①白细胞介素1β组、实验组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05),实验组低于白细胞介素1β组(P<0.05);②白细胞介素1β组、实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量高于对照组(P<0.05),基质金属蛋白酶抑制剂1表达量低于对照组(P<0.05);实验组基质金属蛋白酶4、基质金属蛋白酶3表达量低于白细胞介素1β组,基质金属蛋白酶抑制剂1表达量高于白细胞介素1β组(P<0.05);③白细胞介素1β组、实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性高于对照组(P<0.05),实验组caspase-3、caspase-8、caspase-9相对活性低于白细胞介素1β组(P<0.05);④结果表明,人脐带华通胶间充质干细胞对白细胞介素1β诱导的髓核细胞退变凋亡有明显的抑制作用.
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Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔髓核细胞
背景：椎间盘为负重却缺乏血运的组织，在体外培养过程中存在表型丢失问题，因而容易发生退行性改变，但椎间盘退变的机制尚不明确。
目的：探讨兔髓核细胞分离、贴壁培养、扩增和鉴定的方法，并观察髓核细胞在不同代次的生长特性。
方法：应用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合的方法，分离、纯化髓核细胞并进行体外扩增，用倒置显微镜观察各代细胞的形态、生长状况，计数细胞数量，并绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红染色后光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学方法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达情况，并进行细胞鉴定。
结果与结论：成功的实现了兔髓核细胞体外分离、培养及扩增。生长特性观察发现，髓核细胞第1-3代细胞增殖能力强，活力旺盛，但随着传代次数的增加，细胞增殖能力程逐渐下降的趋势。分离培养的髓核细胞阳性表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。体外采用Ⅱ型胶原酶消化法和组织块贴壁法相结合，可获得高纯度的髓核细胞，培养的髓核细胞呈类圆形或多角形生长，第1-3代细胞生长活性较强。 -
胰岛素样生长因子1通过PI3K/Akt信号通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达
背景:采用生长因子等生物学方法修复退变椎间盘是目前椎间盘退变治疗的研究热点,胰岛素样生长因子1能促进髓核细胞增殖、促进功能性细胞外基质的合成,但其机制仍未阐明.目的:观察胰岛素样生长因子1对髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的促进作用,并探讨其信号转导机制.方法:分离培养人髓核细胞,取第3代细胞给予不同质量浓度的胰岛素样生长因子1(0,20,50,100,200μg/L)进行刺激,采用RT-PCR、Western-blot检测聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达.100μg/L的胰岛素样生长因子1作用于髓核细胞,采用Western-blot检测胰岛素样生长因子1对PI3K/Akt信号通路的激活作用,并通过LY294002的应用检测PI3K/Akt通路的抑制对聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的影响.结果与结论:①随胰岛素样生长因子1质量浓度增高,聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达水平逐渐升高,该作用呈剂量依赖性.胰岛素样生长因子1(100μg/L)能显著促进p-PI3K和p-Akt的表达(P<0.01),而LY294002能抑制胰岛素样生长因子1的促进作用(P<0.01);②胰岛素样生长因子1(100μg/L)能促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达(P<0.01),而LY294002能抑制胰岛素样生长因子1对聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原表达的促进作用(P<0.01);③因此认为胰岛素样生长因子1可通过PI3K/Akt通路促进髓核细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的表达.
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结缔组织生长因子在椎间盘退变中作用机制的研究进展
结缔组织生长因子(CTGF/CCN2)在细胞外基质合成的过程中具有重要作用,且在骨、软骨与椎间盘中这种作用尤为重要.目前,该因子在椎间盘中的功能和调控受到越来越多的关注.本文讨论了CCN2在椎间盘中的功能以及转化生长因子β(TGF-β)和低氧,这两个重要因素对CCN2的调控作用.现有的文献显示CCN2在椎间盘中可能发挥了促合成的作用,并且可能与细胞外基质的平衡相关.对CCN2的进一步研究可能会对椎间盘退变生物治疗具有指导作用.
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补气活血方及共拆方对大鼠椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1的作用
目的:研究补气活血方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘髓核细胞Sox9、TGF- β1表达的影响.方法:用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析补气活血方及其拆方补气方、活血方药理血清对诱导凋亡大鼠椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1表达的影响.结果:补气活血方、补气方、活血方组相比,Sox9表达升高,TGF-β1表达降低,均有统计学意义(P＜0.01)；补气活血方组与补气方、活血方组比较,TGF-β1表达明显降低,有统计学意义(P＜0.05).结论:补气活血方及其拆方可以调控大鼠椎间盘髓核细胞内TGF- β 1、Sox9表达,其延缓椎间盘退变的机制可能与调控细胞的凋亡相关因子有关.
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miR-155过表达髓核细胞IncRNA表达谱芯片分析及对凋亡功能的影响
目的 探讨在椎间盘退变过程中miR-155过表达髓核细胞IncRNA对凋亡功能的影响及机制.方法 采用miR-155慢病毒载体过表达人椎间盘细胞髓核细胞,IncRNA芯片检测并通过基因组数据库(Ensemble)筛选出可能通过miR-155参与髓核细胞凋亡调控的IncRNA;将筛选出的GAS5 IncRNA转染髓核细胞,流式细胞术检测过表达GAS5 IncRNA后髓核细胞的凋亡情况;Western印迹法检测线粒体通路上两个关键凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3和B淋巴细胞瘤/白血病(Bcl)-2的表达情况.结果 经IncRNA芯片分析共发现630个差异表达IncRNA,其中381个IncRNA表达上调、249个In-cRNA表达下调.Ensemble显示,GAS5 IncRNA共包含有30个转录本,本次IncRNA芯片分析获得了13个转录本表达情况,均呈下降趋势,其中GAS5-016转录下调差异有统计学意义(Fc值≥1.5,P<0.05).GAS5 IncRNA过表达髓核细胞后,流式细胞术分析显示,GAS5 IncRNA过表达组髓核细胞早期凋亡率明显高于阴性对照组(P<0.05);GAS5 IncRNA过表达组髓核细胞中Caspase-3蛋白表达水平明显高于阴性对照组,Bcl-2蛋白表达水平明显低于阴性对照组(均P<0.05).结论 IncRNA在人退变椎间盘髓核细胞凋亡中发挥重要作用,GAS5 IncRNA过表达可上调Caspase-3表达并下调Bcl-2表达同时激活细胞内的线粒体凋亡通路,促进髓核细胞凋亡;miR-155可能参与了GAS5 IncRNA调控髓核细胞凋亡的过程,但二者的相互调控机制仍需进一步研究.
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旋转式生物反应器内构建组织工程椎间盘
目的:探讨旋转式生物反应器(RCCS)对髓核细胞功能表达和组织工程髓核结构的影响.方法:将体外扩增培养的兔髓核细胞接种于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架上.治疗组在RCCS内培养,对照组静态培养.培养4周后取出细胞与支架复合物,行大体标本观察、组织学和免疫组织化学染色观察.结果:RCCS下构建的组织工程髓核的厚度、大小及组织弹性好于对照组,Ⅱ型胶原免疫组化染色面积百分比明显高于对照组(15.0±4.6比6.5±2.2),差异有统计学意义(P＜0.05).结论:旋转式生物反应器能促进髓核细胞增加Ⅱ型胶原的分泌,有利于在体外构建组织工程髓核.
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大鼠髓核细胞原代培养及表型鉴定
目的:探讨Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离培养髓核细胞及免疫细胞化学表型鉴定的可行性.方法:无菌务件下分离SD大鼠凝胶状髓核,采用Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离髓核细胞并连续培养,倒置相差显微镜下观察,随后进行免疫细胞化学染色检测不同代次髓核细胞HIF-1、Ⅰ、Ⅱ型胶原、MMP2及蛋白聚糖的表达情况,并给予MTT法测定髓核细胞生长曲线.结果:Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶分离培养原代髓核细胞需要12d左右贴壁,达95％融合需要34d,而传代髓核细胞贴壁速率明显增快至10h,且其倍增时间约为2.5d;免疫细胞化学显示髓核细胞均表达HIF-1、Ⅰ、Ⅱ型胶原、MMP2和蛋白聚糖,且随着髓核细胞传代其HIF-1α、HIF-1p、Ⅰ型胶原及MMP2表达均增加,但Ⅱ型胶原表达降低,而蛋白聚糖表达无明显差异;MTr法显示随着髓核细胞传代其增殖有所减缓.结论:Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶可成功分离髓核细胞,提高培养效率,且HIF-1α、HIF-1β、Ⅰ、Ⅱ型胶原及MMP2可作为髓核细胞表型分子用于髓核细胞的鉴定.
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hBMP-7基因转染对原代培养兔髓核细胞生物学活性的影响
目的:探讨原代培养的兔髓核细胞转染腺病毒载体介导的人骨形态发生蛋白-7(hBMP-7)基因后对其生物学活性的影响.方法:根据兔髓核细胞转染方式的不同,分为hBMP7组、LacZ组、未转染组三组,hBMP7组采用腺病毒载体介导的hBMP7进行转染,LacZ组转染LacZ基因,未转染组不转染任何基因.比较三组细胞增殖、硫酸糖胺多糖(GAG)产量、Ⅱ型胶原产量有无差异.结果:处理方式和转染后时间对细胞增殖、GAG产量、Ⅱ型胶原产量有交互作用(P＜0.05),hBMP7组细胞增殖、GAG产量、Ⅱ型胶原产量高于LacZ组、未转染组,差异有统计学意义(P＜0.05),LacZ组和未转染组细胞增殖、GAG产量、Ⅱ型胶原产量差异无统计学意义(P＞0.05).结论:hBMP-7基因转染可提高髓核细胞增殖能力,促进其产生细胞外基质.
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胰岛素样生长因子-1对骨髓间充质干细胞分化类髓核细胞的作用
目的:观察不同浓度胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化成类髓核细胞的作用.方法:应用3月龄新西兰大白兔骨髓和髓核进行BMSCs及髓核细胞的分离培养与鉴定;将第2代BMSCs和原代髓核细胞构建共培养体系,实验组加入不同浓度IGF-1(0、10、50、100、150 μg/L)的无血清培养液诱导5、10、15、20、25 d;以10％胎牛血清的培养基单独培养BMSCs作为阴性对照.利用免疫印迹检测各组BMSCsⅡ型胶原及蛋白聚糖的表达情况.结果:100 μg/L IGF-1诱导液诱导的BMSCsⅡ型胶原和蛋白聚糖蛋白水平高于对照组和其他实验组.结论:100 μg/L IGF-1能提高兔BMSCs体外诱导分化成类髓核细胞的数量.
关键词： 胰岛素样生长因子-1 骨髓间充质干细胞 髓核细胞 -
大鼠髓核细胞体外衰老模型的建立
目的：建立大鼠椎间盘髓核细胞体外衰老模型。方法：提取大鼠椎间盘髓核细胞，在完全培养基中培养，作为对照组；在对照组基础上加入终浓度为100μmol／L三丁基过氧化氢（t‐BHP）培养2 h ，构建髓核细胞体外衰老模型（衰老模型组）。采用Western印迹法检测两组髓核细胞的衰老相关指标微囊蛋白‐1（caveolin‐1）、β‐半乳糖苷酶（SA‐β‐gal）的表达量，同时采用CCK‐8细胞增殖实验检测两组的细胞活性。结果：与对照组比较，t‐BHP作用2 h后，衰老模型组caveolin‐1、SA‐β‐gal表达量明显升高，且髓核细胞增殖速率减慢，细胞活性明显降低。结论：采用t‐BHP诱导的方法能成功构建髓核细胞体外衰老模型， caveolin‐1在此过程中诱发了髓核细胞的衰老。
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细胞内 Zn2＋内流减少在低氧保护髓核细胞中的作用及其机制
目的：探讨细胞内Zn2＋的浓度在低氧调节髓核细胞表达金属蛋白酶（metalloproteinases ，MMPs）和细胞外基质（ECM）中的作用及其机制。方法：从SD大鼠中提取髓核细胞后首先进行平面培养，然后用藻酸钠凝胶进行三维培养。采用Fluo‐Zin‐3 AM染色法检测细胞内Zn2＋的浓度（intracellular Zn2＋concentration ，[Zn2＋]i）；采用阿利新蓝染色分析细胞分泌蛋白多糖的含量，采用二甲基亚甲蓝分光光度法（DMMB）检测糖胺聚糖的表达水平，采用real‐time PCR分析II型胶原（α1 type II collagen ，COL2A1）、金属蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP‐13）和解整合素样金属蛋白酶5（a disintegrin and met‐alloproteinase with a thrombospondin motif 5，ADAMTS‐5）mRNA的表达。通过免疫组化法和Western印迹法分析锌铁转运蛋白8（ZRT ，IRT‐like protein 8，ZIP8）的表达水平。结果：IL‐1β和ZnCl2可以显著提高髓核细胞内的[Zn2＋]i ，但是该作用可以被低氧所抑制。在藻酸钠三维培养的髓核细胞中，低氧可以显著改善 IL‐1β和 ZnCl2引起的蛋白多糖、糖胺聚糖和COL2A1 mRNA的降低，但ZnCl2可以抑制低氧的保护作用。细胞内Zn2＋的螯合剂和低氧可以抑制MMP‐13 mRNA水平的升高。IL‐1β和ZnCl2促进髓核细胞中ZIP8的表达升高，但是低氧可抑制ZIP8的表达。结论：低氧可以调节髓核细胞中Zn2＋的内流，Zn2＋介导了低氧对髓核细胞中M M P‐13和ECM的调节作用。[Zn2＋]i的变化可能参与了椎间盘退变的过程。
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椎间盘细胞增殖和分化的研究进展
椎间盘退化是导致椎间盘病变及腰部疼痛的主要原因之一。椎间盘退化的原因包括：髓核细胞的功能降低和数量减少以及蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白等基质成分的减少［1-2］；遗传因素、机体衰老以及椎间盘营养缺失、过度受压；椎间盘特殊的内环境如高渗、低氧、低营养、高酸性等［3-6］。现就椎间盘细胞增殖和分化的研究进展作一综述。
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髓核细胞中活化T细胞核因子对ADAMTS-4启动子的调控作用
目的 观察活化T细胞核因子(NFAT)-1、4、5在髓核细胞中对聚蛋白聚糖酶ADAMTS-4启动子活性的影响,初步探讨椎间盘退变可能的分子机制.方法 将ADAMTS-4-pβ-gal-Basic质粒经限制性内切酶Xho Ⅰ及HindⅢ酶切后插入到PGL3-Basic质粒中,经筛选后获得纯化的PGL3-ADAMTS-4质粒.离体培养后,使用Lipofectamine 2000系统进行转染实验,将NFAT-1、NFAT-4、NFAT-5以及DN-TonEBP质粒和PGL3-ADAMTS-4质粒共转染大鼠髓核细胞.将正常髓核细胞和转染后的髓核细胞分别作为对照组和实验组.用双荧光素酶报告基因检测系统测髓核细胞中NFAT-1、NFAT-4、NFAT-5对ADAMTS-4基因启动子活性的影响.结果 构建了ADAMTS-4基因双荧光素酶报告质粒,发现2个NFAT结合元件.与对照组相比,转染NFAT-1的髓核细胞中ADAMTS-4启动活性被抑制(P＜0.05),而转染NFAT-4、NAFT-5以及DN-TonEBP的髓核中ADAMTS-4启动子活性改变无统计学意义(P＞0.05).结论 NFAT-1可调控ADAMTS-4的表达,可能在椎间盘生理以及退变过程中对蛋白聚糖的含量起重要调控作用,为椎间盘退变的生物学治疗提供了一个新的策略.
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低氧诱导因子在髓核细胞生理功能调节中的作用机制研究进展
椎间盘退变是临床常见难题下腰痛的主要病因之一.而髓核细胞表型的改变、细胞生存时间的减少、代谢活动的降低和细胞外基质含量下降均被认为与椎间盘退变相关.椎间盘是身体内大的无血管组织,在体内显著的特点就是氧含量偏低.低氧诱导因子(H IF)是一种转录因子,细胞在低氧条件下诱导产生HIF从而引发一系列的细胞反应来适应低氧的外环境.HIF通过与低氧反应元件(HRE)结合以启动靶基因的转录表达.目前研究认为,HIF在椎间盘退变的病理进程中具有重要作用,可能是未来阻遏椎间盘退变进展甚至治愈这一临床难题的关键靶点.本文综述了HIF对于髓核细胞新陈代谢活动的调节作用,包括HIF在髓核细胞的表达以及HIF对于髓核细胞表型、生存、新陈代谢以及细胞外基质生成的调控.
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退变兔髓核细胞和正常髓核细胞生物学特性的比较
目的 探讨退变和正常兔髓核细胞的不同生物学特性.方法 分离和培养原代兔椎间盘髓核细胞,体外传至第5代使其发生退变,细胞分成原代髓核细胞组(原代)和第5代退变细胞组(退变),用倒置显微镜和HE染色观察其形态学变化,用番红O染色观察糖胺聚糖的变化,用Ⅱ型胶原免疫组织化学观察Ⅱ型胶原的变化.结果原代兔髓核细胞在体外传至第5代后,细胞由类软骨细胞样的星形或多角形变为梭形或纤维长条形.番红O染色显示,退变组红色平均染色面积显著低于原代(P<0.05),免疫组织化学染色显示,退变组棕黄色平均染色面积显著低于原代(P<0.05).结论 原代兔髓核细胞在体外传到第5代时由类软骨细胞样变成纤维细胞样,且糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的含量显著下降,为进一步构建体外髓核细胞退变模型提供了依据.
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大鼠尾椎间盘髓核细胞的分离、培养与鉴定
目的:利用单纯Ⅱ型胶原酶消化法从大鼠尾椎间盘获取髓核细胞,拓展组织工程髓核细胞的获取途径.方法:单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离培养大鼠尾椎间盘髓核细胞,镜下观察细胞形态,行HE、甲苯胺蓝、免疫组化及免疫荧光染色鉴定观察;取原代和传代细胞行细胞活性检测;取P1代细胞检测,绘制生长曲线并行细胞周期分析.结果:成功分离出大鼠尾椎间盘髓核细胞.P0代细胞中包含多角形类软骨样细胞、体积大且胞浆中含有大量空泡的脊索样细胞;经传代纯化后终得到较高纯度的软骨样髓核细胞.台盼蓝细胞活力测定P0代活力高达99％,到P3代细胞活力稍下降,为95％ ～97％.细胞生长曲线及周期测定示P1代细胞有较强增殖潜能,活力旺盛.胞浆内蛋白聚糖被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫组化呈阳性,表现为黄褐色沉淀;Ⅱ型胶原免疫荧光染色示强阳性表达.结论:大鼠尾椎髓核组织可以提供代谢旺盛、维持类软骨表型的髓核细胞.
