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高糖和脂多糖对腹膜间皮细胞β连环蛋白表达及纤维化的影响
腹膜间皮细胞(PMC)在腹膜纤维化中起着关键作用,在炎性反应及非生理性高糖透析液的环境下,其形态、结构及功能都发生了变化.在糖尿病肾病发病过程中,肾小管上皮细胞内的β连环蛋白( β-catenin)含量及表达上调,使下游转分化及致炎、致纤维化因子高表达[1].一、材料与方法1.实验动物:SD大鼠,体质量160～200 g,普通级,由中国医科大学实验动物中心提供.2.药品和试剂:DMEM-F12干粉培养基(美国Hyclone),胎牛血清(天津灏阳),Trizol试剂(美国Invitrogen),实时RT-PCR试剂盒(大连TaKaRa),PCR引物由北京华大基因公司合成,兔抗3-catenin多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色液(武汉博士德),Wnt通路中的关键酶GSK-3β.
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辛伐他汀对高糖致人腹膜间皮细胞转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子分泌与表达的影响
腹膜纤维化是腹膜透析治疗的主要并发症,终导致透析效率降低甚至超滤失败.研究表明,高糖透析液能上调腹膜间皮细胞(HPMC)转化细胞生长因子β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达[1],而后两者是参与腹膜纤维化的重要细胞因子[2].本研究采用RT-PCR和ELISA的方法观察辛伐他汀对高糖刺激下HPMC TGF-β1和bFGF mRNA表达和蛋白分泌的影响,探讨辛伐他汀在腹膜纤维化防治中的作用及其机制.
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血管紧张素Ⅱ对大鼠腹膜间皮细胞表达细胞外基质的调控作用
腹膜纤维化(PF)可导致超滤衰竭,是长期腹透(PD)患者的主要并发症之一.细胞外基质(ECM)过度积聚是PF的特征性改变,与ECM合成和降解间的动态平衡受到破坏有关.现已证实腹膜间皮细胞(PMC)能产生纤连蛋白(FN)[1].金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)和纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)可通过抑制蛋白降解酶活性减少ECM降解.本研究观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)表达FN、TIMP-1及PAI-1的影响,并探讨有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的3个组份,即胞外信号调节蛋白激酶通路(ERK)、蛋白激酶p38通路(p38 MAPK)和c-Jun-氨基末端激酶通路(JNK)在AngⅡ促进RPMC表达FN中所起的作用.
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一种新的大鼠慢性腹膜纤维化动物模型的建立
腹膜纤维化是长期腹膜透析患者常会出现的并发症,它可导致腹膜结构和功能丧失,是患者退出腹膜透析的主要原因之一[1].有研究表明腹膜透析液中的高糖、低pH值及反复发生的腹膜炎是导致腹膜纤维化的主要原因[2,3].目前,国内外尚无一个公认的符合临床病理生理过程的慢性腹膜纤维化模型.因此本实验的目的就是探讨建立一个能反映慢性腹膜纤维化发生发展过程的腹膜纤维化动物模型,为进一步研究腹膜纤维化的发生机制及其防治奠定基础.
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腹膜透析患者肾素血管紧张素Ⅱ水平变化及其在腹膜纤维化中的意义
目的 探讨持续性非卧床腹膜透析(CAPD)患者血浆及腹腔局部肾素血管紧张素系统(RAS)的变化及其在腹膜纤维化中的意义.方法 选取腹透感染组和非感染组CAPD患者25例,非感染患者根据透析龄分为≥6月组和＜6月组.应用放射免疫法检测CAPD患者腹透透出液和血浆中肾素及血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)的浓度.以不同浓度D-葡萄糖(0.3%、1.5%、2.5%)、甘露醇(1.5%、2.5%)及Ang Ⅱ(0、1、10、100、1000 nmol/L)刺激大鼠腹膜间皮细胞(RPMC),放射免疫法检测细胞上清液Ang Ⅱ浓度变化;实时定量PCR方法 观察Ang Ⅱ 1型受体(AT1)、血管紧张素转化酶(ACE)、转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的表达;Western印迹法检测TGF-β1及CTGF蛋白的表达;ELISA法检测上清液中TGF-β1的变化.结果 CAPD患者腹透透出液中未检测到肾素.感染及≥6月组的CAPD患者透出液中Ang Ⅱ的浓度分别为(151.99±114)pmol/L和(14.17±41.5)pmol/L,分别为非感染[(7.98±12.69)pmol/L]及＜6月组[(2.18±5.62)pmol/L]的19倍及6.5倍(P＜0.01或P＜0.05).高糖腹透液(2.5%)注入4 h后,CAPD患者循环中肾素及Ang Ⅱ浓度分别为[(4.30±8.48)和(54.19±34.43)pmol/L],是基础水平的4.06倍和1.21倍(P＜0.01).高糖组(2.5%)RPMC AT1、ACE mRNA和上清液Ang Ⅱ浓度分别为低糖组(0.3%)的2.61、2.62和2.01倍(P＜0.05).Ang Ⅱ可在mRNA和蛋白水平上调RPMC表达TGF-β1与CTGF,呈剂量依赖性,100 nmol/L组TGF-β1 mRNA及蛋白水平分别为对照组的2.8和2.19倍(P＜0.05);1000 nmol/L组CTGF mRNA及蛋白水平分别为对照组的4.48倍和2.82倍(P＜0.05).Ang Ⅱ促进RPMC分泌TGF-β1,呈时间依赖性,刺激24 h组TGF-β1的表达量为基础值的3.65倍(P＜0.05).结论 CAPD尤其是腹透感染或长期腹透患者存在RAS活化状态.RAS的主要效应因子Ang Ⅱ可通过上调间皮细胞表达和分泌致纤维化细胞因子参与腹膜纤维化.阻断RAS可能成为预防和治疗腹膜纤维化的新靶点.
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miR-200a在腹膜透析相关性腹膜纤维化中的表达
目的 通过基因芯片技术寻找与腹膜纤维化相关的关键性miRNA,体内外实验验证其表达,确定其与腹膜纤维化的关系.方法 30只雄性昆明小鼠被分为对照组和实验组.腹腔注射脂多糖(LPS)+高糖透析液建立腹膜纤维化小鼠模型.芯片法检测腹膜组织miRNA表达谱,寻找纤维化腹膜组织中差异表达的miRNA.进一步扩大样本量,用实时定量PCR法验证差异miRNA(miR-200a)表达水平.转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,建立体外腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(EMT)模型,分别用细胞免疫荧光、Western印迹、RT-PCR法检测人腹膜间皮细胞中E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、纤连蛋白(FN)的表达变化及定位,实时定量PCR、Taqman探针法检测体外间皮细胞EMT模型中miR-200a的表达变化.结果 与对照组相比,实验组小鼠腹膜组织有差异表达的miRNA表达谱.差异倍数＞2的miRNA有8个,其中miR-200a表达明显下调(差异倍数3.31,P＜ 0.05).实时定量PCR验证了miR-200a在腹膜组织中的表达.体外TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT模型中发现:分别用TGF-β1作用1、2、3h后,腹膜间皮细胞的miR-200a表达水平明显下调,作用lh时下调了46％ (P＜ 0.05).结论 miR-200a在纤维化腹膜组织及腹膜间皮细胞EMT过程中的表达明显下调,提示miR-200a与腹膜纤维化过程密切相关.作用机制可能为其影响相关靶基因,参与调控腹膜间皮细胞EMT,影响腹膜纤维化过程.
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TGF-β/smads与腹膜纤维化及调节机制系列研究
腹膜纤维化是维持性腹膜透析(腹透)病人重要的并发症,是导致腹膜结构和功能改变的主要原因,也是影响腹透病人长期存活和预后的重要因素.TGF-β是一种多功能的生长因子,也是多种器官和组织纤维化的关键因子.我们针对TGF-β及其信号蛋白Smads在腹膜纤维化中的作用机制及调控因素进行了下述几方面的研究:①TGF-β在腹膜纤维化中的作用及机制;②上调表达smad7在腹膜纤维化防治中的作用;③TGF-β/Smad在急性腹膜炎中的作用及机制;④调节TGF-β作用的信号通路及机制.我们系列研究的结果表明,TGF-β1/Smads信号通路在腹膜纤维化的过程中发挥了至关重要的作用,上调表达抑制性信号蛋白Samd7对于腹透相关腹膜纤维化的防治具有潜在临床应用价值.
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大黄素对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的抑制作用及机制
目的 探讨大黄素对腹膜透析大鼠腹膜纤维化的抑制作用及机制.方法 腹膜纤维化大鼠分为3周模型组(B组)、6周模型组(C组)、大黄素治疗组(D组),每组10只,选取10只未造模大鼠为空白对照组(A组).观察各组大鼠超滤量、血糖转运量、PⅢNP水平及腹膜厚度.比较模型大鼠与治疗组大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白及mRNA的表达.结果 B组、C组大鼠的超滤量低于A组,血糖转运量、PⅢNP水平及腹膜厚度明显升高(P<0.05);D组与C组相比,超滤量明显升高,血糖转运量、PⅢNP水平及腹膜厚度明显降低(P<0.05);C组大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白及mRNA表达均明显高于D组大鼠(P<0.05).结论 大黄素治疗能明显增加腹膜纤维化大鼠超滤量,降低腹膜间胶原沉积,抑制腹膜增厚,其机制可能与抑制Notch1通路信号蛋白表达相关.
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腹膜透析相关性腹膜纤维化发生机制及治疗新进展
腹膜透析(PD)是肾脏替代治疗主要措施之一,但其并发症腹膜纤维化(PF)可引起腹膜超滤功能下降,导致患者腹透毒素清除效能降低,甚至终止PD治疗.因此,探索PD相关性PF的发病机制并据此制定相应的防治措施对提高患者透析效率及延长患者生存时间具有重要意义.本文将从宏观水平、细胞水平及分子水平对PF发生发展机制进行阐述.根据上述机制,综述近年来PF的干预措施的研究新进展.
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全反式维甲酸对大鼠腹膜透析模型腹膜TGF-β1和COL-Ⅰ表达的影响
目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对大鼠腹膜透析模型腹膜转化生长因子-β1(TGF-β1)和胶原Ⅰ(COL-Ⅰ)表达的影响,初步探讨其对腹膜纤维化的作用机制.方法 建立大鼠腹膜透析模型,ATRA 2 mg/kg(小剂量组)、5 mg/kg(大剂量组)每日腹腔内注射进行干预.在实验第28 d取腹膜组织进行Masson染色,免疫组织化学检测TGF-β1、COL-Ⅰ在脏层腹膜的表达;RT-PCR检测TGF-β1 mRNA的表达.结果 Masson染色显示,模型组腹膜较对照组明显增厚,胶原大量沉积;ATRA治疗组腹膜病变均有不同程度减轻.免疫组化和RT-PCR结果表明,模型组腹膜组织中TGF-β1和COL-Ⅰ的表达明显高于对照组,小、大剂量ATRA组表达均显著降低,且大剂量组较小剂量组表达低.结论 ATRA可以下调TGF-β1的表达和抑制COL-Ⅰ的合成,延缓腹膜纤维化的进展.
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血管紧张素转换酶抑制剂与醛固酮受体拮抗剂对腹膜纤维化的比照研究
目的:探讨腹膜纤维化的防治措施.方法:40只雄性Wistar大鼠随机分成4组,A组腹腔内每日注入20毫升4.25%百特透析液;B组腹腔内每日注入20毫升4.25%百特透析液, 同时血管紧张素转换酶抑制剂一平苏10 mg/kg·day管喂;C组(10只)腹腔内每日注入20毫升4.25%百特透析液,同时醛固酮受体拮抗剂安体舒通100 mg/kg·day管喂.D组(10只)正常对照组,每日腹腔内注入生理盐水20毫升.ABC三组从试验开始时于试验第1、3、5、7天按大鼠体重给于腹腔注射脂多糖(LPS)0.6 mg/kg,并于第1天测定腹透液中的转化生长因子-β.30天后收集大鼠腹膜作病理,并测定腹透液中的转化生长因子-β.结果:给药组(B,C组)的腹膜病理改变比模型组(A组)轻,转化生长因子-β浓度也明显下降,具有统计学意义. 结论:血管紧张素转换酶抑制剂及醛固酮受体拮抗剂能有效的防治腹膜纤维化的进程.
关键词： 腹膜纤维化 血管紧张素转换酶抑制剂 醛固酮受体拮抗剂 转化生长因子-β -
转化生长因子-β对大鼠腹膜纤维化的防治研究
目的 探讨腹膜纤维化的防治措施.方法 Wistar大鼠30只随机分成三组.A组为模型组,每日腹腔注射4.25%的百特透析液20 ml,B组为给药组每日腹腔注射透析液同时灌胃给药(血管紧张素转换酶抑制剂)一平苏,C组为空白对照组,每日腹腔注入生理盐水20 ml.试验开始30天后取大鼠腹膜作病理组织学检查,同时收集血清和腹透液测定转化生长因子-β.结果 A组和B组的腹膜明显纤维化并且转化生长因子-β血清和腹透液中都有增加,与C组差异都有显著性.结论 高糖可以诱导腹膜纤维化.腹膜纤维化时转化生长因子-β血清和腹透液中都升高并且可被一平苏抑制.3平苏有抗腹膜纤维化的作用.
关键词： 转化生长因子-β 腹膜纤维化 血管紧张素转换酶抑制剂 -
白芍总苷与辛伐他汀对腹膜纤维化大鼠腹膜功能的影响
目的:比较白芍总苷与辛伐他汀对腹膜纤维化大鼠腹膜功能的影响.方法:选用健康SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只,分别为:空白组、模型组、辛伐他汀组、白芍总苷组.用持续4.25％含糖透析液和间断脂多糖腹腔注射进行腹膜纤维化造模.辛伐他汀组每日给予辛伐他汀20mg.kg-1.d 1灌胃,白芍总苷组每日给予白芍总苷灌胃200 mg.kg-1.d-1；实验第30天结束后检测腹膜功能及测量腹膜厚度.结果:模型组的腹膜厚度厚,腹膜超滤量差,与其他3组有显著性差异(P＜0.05).辛伐他汀组、白芍总苷组的腹膜厚度及腹膜超滤量与空白组相比,有显著性差异(P＜0.05).辛伐他汀组腹膜厚度与白芍总苷组相比,有显著性差异(P＜0.05).辛伐他汀组超滤量与白芍总苷组相比,无显著性差异(P＞0.05).结论:白芍总苷和辛伐他汀均可一定程度保护腹膜,预防腹膜纤维化的发生.
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百令胶囊对尿毒症腹膜透析患者腹透液中转化生长因子-β1、纤维连接蛋白表达的影响
目的 研究百令胶囊对尿毒症腹膜透析患者腹透液中转化生长因子-β1(transforming growth fac-tor-β1,TGF-β1)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)水平的影响.方法 将腹膜透析患者60例随机分为对照组和试验组(各30例),均应用1.5%腹膜透析液、6000 mL/d,试验组加用百令胶囊5粒、3/d、口服,观察1、3、6个月后2组腹透液中TGF-β1、FN水平的变化.结果 对照组TGF-β1、FN水平随透析时间延长逐渐升高;试验组TGF-β1、FN水平无明显变化,与对照组比较明显降低(P<0.05).结论 百令胶囊可以降低腹透液中TGF-β1、FN水平,能起到抑制腹膜纤维化的作用.
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腹膜纤维化机制与治疗新进展
腹膜透析作为一种有效的肾脏替代治疗,在终末期肾病中运用日渐广泛,甚至成为肾脏替代治疗的首选方案.但长期的腹膜透析会导致腹膜功能下降、腹膜结构改变,终演变成腹膜纤维化,甚至包裹性腹膜硬化症,使超滤失败,严重时使患者退出腹膜透析.目前国内外研究主要包括:上皮细胞一间充质转化、腹膜透析液的生物不相容性、血管紧张素一醛固酮系统、氧化应激、腹膜炎症、全身微炎症状态、基因调控、生长及转化因子等,针对上述发病机制,提出了相应的治疗方法.
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PPAR-γ激动剂罗格列酮对大鼠腹膜纤维化的防治作用
目的:通过高糖加红霉素腹腔注射造成大鼠腹膜纤维化模型,观察罗列格酮对实验性腹膜纤维化的防治作用及可能机制.方法:将24只SD大鼠随机分为3组(模型组、罗格列酮组、正常对照组),大鼠处死测胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖,观察腹膜纤维化的程度,用免疫组化方法检测腹膜组织中的TGF-β1、VEGF表达明显水平.结果:组织学检查发现模型组较治疗组腹膜纤维化程度减轻.免疫组化结果半定量分析显示,治疗组的TGF-β1、VEGF水平较模型组也明显减轻.结论:罗格列酮可使TGF-β1及VEGF表达下调,新生血管减少,腹膜纤维化减轻,提示其具有改善腹膜纤维化,维持腹膜功能的作用.
