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PCB77人工抗原的合成及多克隆抗体的制备
目的:制备PCB77人工抗原和多克隆抗体,为建立其免疫学检测方法提供技术准备.方法:以3,4-二氯苯基乙酸为半抗原,在低温和弱碱性条件下,采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法将其与载体BSA偶联,制备PCB77的人工抗原,计算结合比为23:1,免疫家兔获得了PCB77的多克隆抗体.采用混合酸酐法将半抗原与OVA偶联,结合比为8:1,用作ELISA检测包被原.间接ELISA检测结果表明,2只兔子的抗血清效价均达1:20 000以上.抗血清经辛酸一硫酸铵沉淀法纯化后通过ELISA检测验证了PCB77人工抗原的有效性,通过方阵滴定法确定ELISA的佳工作浓度,建立标准曲线.在0.75～300 ng/L范围内,抑制率与PCB77的质量浓度对数呈显著的线性关系,检测限达到4.44μg/L.结论:合成的PCB77人工抗原具有较好的免疫效果,纯化后的抗体符合后续实验的条件要求,为研制和开发PCB77免疫检测试剂盒奠定了基础.
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G-CSF对帕金森病小鼠运动能力和黑质纹状体神经元的影响
目的:探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTTP)所致小鼠帕金森病(PD)模型中脑黑质致密部(SNpc)及纹状体(STR)多巴胺(DA)能神经元的影响.方法:正常健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、MPTP组及MPTP+ G-CSF组,采用腹腔注射MPTP法制作小鼠PD模型,MPTP+G-CSF组于后一次MPTP注射后再腹腔注射G-CSF.爬杆实验观察小鼠的行为学改变;尼氏染色技术观察各组小鼠黑质致密部神经元数量及形态学变化;免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶(TH)在各组小鼠中脑黑质致密部及纹状体的表达;Western Blot法检测各组小鼠中脑TH蛋白的表达量.结果:与对照组相比,MPTP组小鼠较对照组爬杆用时显著延长(P＜0.05),尼氏染色显示黑质致密部神经元数量显著减少(P＜0.05),黑质致密部、纹状体TH表达量显著减少(P ＜0.05);MPTP+ G-CSF组较MPTP组爬杆用时显著缩短(P＜0.05),神经元丢失减少(P＜0.05),神经元形态较完整;与MPTP组比较,MPTP+ G-CSF组黑质致密部、纹状体TH表达水平显著增高(P＜0.05).结论:G-CSF能够改善PD小鼠运动功能,减少黑质致密部多巴胺能神经元丢失,增加TH表达水平.
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慢性帕金森病模型小鼠的行为学表现和多巴胺能神经细胞及转运体的数量变化
目的:研究慢性帕金森病模型小鼠行为学、黑质致密部多巴胺神经细胞和纹状体多巴胺转运体(DAT)的变化.方法:利用MPTP和二丙苯磺胺联合注射小鼠5周(每周2次,共10次)制作帕金森病小鼠慢性模型,通过转棒法检测小鼠行为学表现,免疫组织化学方法测定黑质内多巴胺能神经细胞的变化,放射自显影技术测定纹状体内DAT的密度.结果:帕金森病小鼠在转棒试验中行为发生明显改变,模型组行为学得分明显低于对照组(895±238 vs 1202 ±252,P＜0.001),酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数也明显低于对照组(10.4±6.5 vs 22.4 ±8.0,P＜0.001).模型组动物纹状体DAT放射自显影灰度值明显低于对照组(0.2123±0.0316 vs 0.3034±0.0588,P＜0.001).线性回归表明,模型组小鼠黑质致密部TH阳性细胞数及纹状体内DAT密度与对应行为学得分呈明显正相关(r＝ 0.6354,P＜0.01).结论:MPTP和二丙苯磺胺所致的帕金森病小鼠,在行为学、纹状体DAT密度和黑质致密部多巴胺神经细胞量上均有明显改变,提示这种小鼠模型可用于研究帕金森病的发病过程和药物治疗.
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p38MAPK抑制剂对MPTP模型小鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用
目的:研究SB239063在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠中抑制p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活化对多巴胺(DA)能神经元的保护作用.方法:雄性C57BL/6N小鼠随机分为MPTP(30 mg/kg)模型组;SB239063(5 mg/kg)抑制剂组;SB239063(15 mg/kg)抑制剂组;SB239063(25 mg/kg)抑制剂组.抑制剂组于每次注射MPTP前3h腹腔注射SB239063;对照组注射与模型组和抑制剂组等量生理盐水和DMSO.采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹法观察各组小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)和磷酸化p38蛋白激酶(p-p38 protein kinase,p-p38MAPK)之间表达变化的关系.结果:模型组小鼠黑质区p38MAPK显著活化,同时伴有TH阳性神经元明显丢失;SB239063 15 mg/kg与25 mg/kg组均可明显减少TH神经元丢失,而5 mg/kg组无显著影响;免疫荧光双标记结果显示p38MAPK与TH阳性神经元存在共表达.结论:p38MAPK对PD模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元丢失可能有重要调控作用,SB239063对多巴胺神经元具有一定的神经保护作用.
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蝎毒耐热蛋白保护MPTP小鼠空间学习记忆障碍的一氧化氮机制
本研究的目的是探讨蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理的伴有空间学习记忆障碍的Parkinson病(PD)小鼠的保护机制.实验共分4组:(1)正常对照组(NS+NS),C57BL/6小鼠颈部皮下注射生理盐水(NS)连续8 d,同时腹腔注射生理盐水,连续8 d;(2)阴性对照组(NS+SVHRP):C57BL/6小鼠颈部皮下注射生理盐水,连续8d,同时腹腔注射SVHRP(0.01 mg/kg)连续8 d;(3)PD模型组(MPTP+NS):C57BL/6小鼠颈部皮下注射MPTP(20 mg/kg)连续8 d制备小鼠PD模型,腹腔注射生理盐水连续8 d;(4)蝎毒治疗组(MPTP+SVHRP):C57BL/6小鼠颈部皮下注射MPTP(20mg/kg)连续8 d,给药后腹腔注射SVHRP(0.01 mg/kg)连续8 d.行为学和形态学研究结果表明,正常对照组和阴性对照组的各项实验数据均无明显差别.爬竿和游泳实验结果表明,与正常对照组相比较,MPTP处理小鼠爬竿(P＜0.01)和游泳(P＜0.01)分数明显降低.Morris水迷宫实验中,MPTP处理小鼠寻找平台潜伏期明显延长(P＜0.01);向目标游泳时间所占百分比明显降低(P＜0.01),而向对侧象限游泳时间所占百分比明显增加(P＜0.01).免疫细胞化学染色结果表明,PD模型组小鼠中脑内黑质致密部呈酪氨酸羟化酶免疫反应阳性的神经元的数目较正常组明显减少(P＜0.01);而海马内神经元型一氧化氮合酶(nNOS)免疫反应阳性的神经元数(P＜0.01)以及NO含量(P＜0.01)均较正常组明显增多.行为学结果表明,与PD组比较,SVHRP处理的PD小鼠的运动协调能力(P＜0.01)和空间学习记忆能力(P＜0.01)均具有明显改善.
关键词： 1-甲基4-苯基-1 2 3 6-四氢吡 Parkinson病 一氧化氮 蝎毒耐热蛋白 神经保护 -
MPTP对小鼠空间学习记忆和脑内强啡肽免疫反应的影响
为了观察1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)对C57BL/6小鼠空间学习记忆能力和脑内强啡肽(DYN)表达强度的影响,本研究给予小鼠皮下注射MPTP 20mg/kg,连续8 d,制备Parkinson病(PD)模型.与对照组相比,MPTP处理小鼠爬竿(P＜0.01)和游泳(P＜0.01)分数明显降低.Morris水迷宫实验结果显示:MPTP处理小鼠寻找平台潜伏期明显延长(P＜0.01),在目标及对侧象限游泳时间所占百分比分别明显降低(P＜0.01)和增加(P＜0.01).免疫细胞化学结果表明中脑黑质致密部的酪氨酸羟化酶(TH)免疫阳性神经元数目明显减少(P＜0.01).同时在前额叶皮层(P＜0.01)、背侧海马的CA1区(P＜0.05)和齿状回-苔状纤维通路(P＜0.05)、背侧尾核(P＜0.01)的DYN免疫反应活性明显增强.本实验结果表明:用MPTP处理诱发的PD小鼠模型伴有空间学习和记忆能力的下降;并提示前额叶皮层、背侧海马的CA1区、齿状回-苔状纤维通路和背侧尾核内DYN表达的增多可能与MPTP小鼠空间学习和记忆能力下降有关.
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Nrf3基因在帕金森病猴模型黑质中表达的研究
本研究目的在于采用mRNA差异显示技术及改进的硝酸银核酸染色技术.寻找1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导侧与对照侧中脑黑质细胞之间的差异表达基因.用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱发单侧帕金森病猴模型后,将两侧黑质mRNA用3'端三个锚定引物与30种随机引物进行逆转录-聚合酶链反应,经聚丙烯酰胺凝胶电泳及硝酸银染色后显示扩增产物条带.结果:对获得的差异表达基因片段的序列分析、同源性比较及功能分析证明,差异基因中的一个(149 bp)为Nrf3基因片段.此结果提示:Nrf3可能参与小胶质细胞的生长,促进对变性神经元的吞噬作用,可为从分子水平了解人类帕金森病的发生机理提供依据.
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TRAIL参与氧合血红蛋白诱导的脑血管内皮细胞凋亡
目的 目前对自发性蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的机制尚不十分清楚,研究认为脑血管内皮细胞的凋亡发挥了重要作用.本实验探讨了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及easpase 3在血管内皮细胞凋亡中作用.方法 在离体培养的脑血管内皮细胞中,观察给予氧合血红蛋白(OxyHb)处理以及给予caspase 3拮抗剂或TRAIL后,运用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测两者在mRNA和蛋白水平表达的改变.结果 和生理盐水阴性对照相比,单纯OxyHb处理以及OxyHb+TRAIL处理后,血管内皮caspase 3表达均显著升高(P<0.05).TRAIL能够上调OxyHb刺激诱导的caspase 3表达(P<0.05).和牛理盐水对照组相比,OxyHb处理后,血管内皮TRAIL表达显著上调(P<0.05).但是,和OxyHb处理相比,caspase 3拮抗剂Ac-DEVD-CHO(ADC)不能明显改,变OxyHb刺激诱导的TRAIL蛋白的表达上调(P0.05).结论 TRAIL能够促进SAH后OxyHb刺激导致的内皮细胞凋亡.在凋亡的级联反应过程中,TRAIL能够活化下游caspase 3,从而启动凋亡过程.因此,TRAIL及其受体在SAH后CVS的发生、发展过程中可能有着重要作用.
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宁夏六盘山区栽培白芍的主要成分含量研究
目的 建立高效液相色谱波长切换法同时测定宁夏六盘山区白芍药材中没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的含量.方法 采用Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;以1 mL·L-1磷酸(A)-乙腈(B)为流动相;梯度洗脱;流速为1.0 mL·min-1;检测波长为275 nm(测定没食子酸),258 nm(测定儿茶素),230 nm(测定芍药内酯苷、芍药苷)和275 nm(测定1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖).结果 没食子酸在564.0~8 460.0 μg范围(r=0.999 6),儿茶素在85.0~1 275.0 μg范围(r=0.999 4),芍药内酯苷在252.0~3 780.0 μg范围(r=0.999 5),芍药苷在993.0~14 895.0 μg范围(r=0.999 4),1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖在221.0~3 315.0 μg范围(r=0.999 6)均呈良好线性关系,平均回收率(n=6)分别为98.18%,97.50%,98.64%,98.21%和97.74%.结论 该方法灵敏度高、重复性好,可同时测定白芍药材中没食子酸、儿茶素、芍药苷、芍药内酯苷和1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的含量.
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滨蒿提取物中3种二咖啡酰奎宁酸的含量测定
目的 建立滨蒿提取物中3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法.方法 采用HPLC法测定,色谱条件:Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.036 mol·L-1磷酸二元梯度洗脱;流速:1.0 mL·min-1;柱温:30 ℃,检测波长:327 nm.结果 3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸分别在0.010 3~0.309,0.009 7~0.291和0.010 5~0.315 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9);加样回收率分别为99.23%,101.30%和100.63%;RSD值分别为1.59%,0.83%和1.23% (n=6);样品溶液在32 h内稳定.结论 该方法操作简便,重复性好,可用于滨蒿提取物的质量控制.
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滨蒿提取物中3种二咖啡酰奎宁酸的含量测定
目的 建立滨蒿提取物中3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的含量测定方法.方法 采用HPLC法测定,色谱条件:Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.036 mol·L-1磷酸二元梯度洗脱;流速:1.0 mL·min-1;柱温:30 ℃,检测波长:327 nm.结果 3,4-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸分别在0.010 3~0.309,0.009 7~0.291和0.010 5~0.315 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9);加样回收率分别为99.23%,101.30%和100.63%;RSD值分别为1.59%,0.83%和1.23% (n=6);样品溶液在32 h内稳定.结论 该方法操作简便,重复性好,可用于滨蒿提取物的质量控制.
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HPLC法测定不同产地首乌延寿片中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量
目的 建立HPLC对首乌延寿片定量的分析方法.方法 采用HPLC法测定2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量.结果 2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-β-D-葡萄糖苷对照品线性范围在0.073 5～0.441 μg,样品平均回收率为95.0%,RSD为2.37%.结论 方法简便、准确、专属性强,能有效的控制首乌延寿片的质量.
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HPLC法测定尿毒清颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量
目的 建立尿毒清颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的测定方法.方法 采用高效液相色谱法.色谱柱为:Ultimate R XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-水(8∶92),梯度洗脱;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:320 nm.结果 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量在0.066 8～0.534 4 μg(r=0.999 5)范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率为99.3%,RSD为0.5%(n=6).结论 高效液相色谱法简便快捷,结果准确,可用于尿毒清颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定及该制剂的质量控制.
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RP-HPLC法测定明珠口服液中2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量
目的 建立明珠口服液(以2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷为定量指标)的质量控制方法.方法 采用RP-HPLC法,色谱条件: Agilent analytical TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈-水(19∶81)为流动相;流速:1 mL·min-1;检测波长320 nm;柱温:30 ℃.结果 2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.050 28～2.011 μg范围内线性关系良好,r=0.999 9;平均加样回收率为103.2%,RSD为0.80%.结论 方法专属性强,结果准确可靠,可作为明珠口服液的质量控制方法.
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HPLC测定当归南枣颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量
目的 建立当归南枣颗粒中2,3,5,4′-四羟基二笨乙烯-2-O-βD-葡萄糖苷的含量测定方法 .方法 采用高效液相色谱法,色谱条件:C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);乙腈-水(21:79)为流动相;流速1.0 mL·min-1;检测波长320nm;进样量10μL;柱温25℃.结果 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量在0.054 75～0.438μg范围内,其峰面积值与进样量(μg)有良好的线性关系,r=0.999 6,回收率为96.9%,RSD为1.3%(n=6).结论 该方法 快速简便,可用于当归南枣颗粒的质量控制.
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HPLC法测定降脂减肥颗粒中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量
目的 建立高效液相色谱法测定降脂减肥颗粒中2,3,5,4 r-四羟基二苯乙烯-2-β-D-葡萄糖苷的含量.方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为C18柱,流动相为乙腈-水(25:75),流速为1.0 mL,·min-1,检测波长为320 nm.结果 2,3,5,4 ′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量在0.402～3.216μg范围内线性关系良好,r=0.999 6,平均回收率为98.4%,RSD为1.2%.结论 该方法 简便、准确、重复性好,可用于降脂减肥颗粒的质量控制.
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HPLC法测定荣发养颜宝胶囊中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量
目的采用HPLC法测定荣发养颜宝胶囊中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量.方法色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱,以乙腈-水(23∶77)为流动相,流速0.8 mL*min-1,检测波长为320 nm.结果平均回收率为98.7%,RSD为1.7%.结论该方法准确、简便,其它组分对测定无干扰,重现性好,可作为荣发养颜宝胶囊的质量控制方法.
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3,6-[二甲氨基]-二苯骈碘杂六环枸橼酸盐对大鼠心肌缺血的保护作用
目的观察3,6-[二甲氨基]-二苯骈碘杂六环枸橼酸盐(I-65)对急性心肌缺血的影响.方法采用结扎左冠状动脉制备大鼠在体心肌缺血模型,于缺血24 h后分别测定心肌梗死范围、血清肌酸激酶、乳酸脱氢酶活性和游离脂肪酸含量.结果I-65能缩小大鼠心肌梗死范围,降低心肌缺血大鼠血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性,减少血清游离脂肪酸含量.结论I-65对大鼠缺血心肌有保护作用.
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UFLC法测定四季抗病毒合剂中4种成分的质量浓度
目的：测定四季抗病毒合剂中绿原酸、1，3‐二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷和3，5‐二咖啡酰奎宁酸的质量浓度。方法采用超快速液相色谱（UFLC）法。色谱条件：色谱柱为Kromasil C18色谱柱（250 mm ×4．6 mm ，5μm）；流动相为乙腈‐3．0 g · L －1磷酸溶液梯度洗脱；流速为0．8 mL · min－1；检测波长为348 nm ；柱温为35℃。结果绿原酸、1，3‐二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷和3，5‐二咖啡酰奎宁酸的线性范围分别为24．00～960．00，22．00～880．00，3．00～120．00和24．00～960．00μg · m L －1，相关系数分别为0.9993，0.9992，0.9996和0.9993；平均回收率分别为98.62％（RSD＝1.16％），98.90％（RSD＝1.67％），98.37％（RSD＝0.95％）和98.35％（RSD＝0.91％）；12批制剂中绿原酸、1，3‐二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷和3，5‐二咖啡酰奎宁酸的平均质量浓度分别为142．91，191．39，16．89和140．20μg · mL －1，RSD值分别为0．97％，1．05％，1．16％和1．20％。结论文章测定的4种成分及建立的方法，可用于四季抗病毒合剂的质量评价。
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肺结核丸质量标准研究
目的：建立肺结核丸的质量标准。方法采用TLC法对制剂中制何首乌、白及进行定性鉴别；采用 HPLC法对制何首乌中的2，3，5，4′‐四羟基二苯乙烯‐2‐O‐β‐D‐葡萄糖苷进行定量测定。结果薄层色谱鉴别何首乌、白及的斑点清晰，分离效果好，阴性对照无干扰；2，3，5，4′‐四羟基二苯乙烯‐2‐O‐β‐D‐葡萄糖苷在6．0～48．0μg·mL －1范围内线性关系良好（r＝0．9993）。平均回收率为99．0％，RSD为0．30％（n＝9）。结论该方法简单准确，专属性强，重复性好，可有效控制该制剂的质量。
