siRNA干扰slug基因表达对IEC-6细胞放射线敏感性影响

目的 探讨siRNA干扰slug基因表达对体外肠隐窝上皮细胞IEC-6接受X线照射的敏感性影响及其机制.方法 以体外培养大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象,将转染siRNA-slug(实验组)、转染siRNA(阴性对照组)和未转染siRNA(空白对照组)的细胞进行X射线照射处理,24 h后,用Western blot法检测各组细胞的Slug和细胞P53正向凋亡上调因子(PUMA)蛋白的表达,CCK8法检测细胞在不同剂量X射线照射下的生长抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 实验组Slug蛋白表达与阴性对照组和空白对照组比较明显降低,PUMA蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组,差异有显著性(F=1 760、421,P＜0.01).与阴性对照组和空白对照组比较,实验组细胞的凋亡率增加,差异有统计学意义(F=33.02,P＜0.01).在0～6 Gy剂量范围内,随着X线照射剂量的增加,各组细胞的增殖活性均降低(F=6.595～31.470,P＜0.05);在6 Gy剂量X线照射下,实验组细胞生长抑制率、早期+晚期凋亡率较阴性对照组和空白对照组明显增高,差异有统计学意义(F=47.700、33.020,P＜0.01).结论 siRNA干扰slug基因的表达能够使促凋亡的PUMA蛋白表达增加,从而增强IEC-6细胞对X射线的敏感性.

IKKβ-RNAi腺病毒构建及其HEK293T细胞表达

目的 构建沉默人IκB激酶β(IKKβ)基因表达的RNA干扰(RNAi)腺病毒,了解其对IKKβ基因表达的作用.方法 根据GenBank IKKβ基因的mRNA,利用RNAi Designer工具软件设计合成4对IKKβ基因的特异性小干扰RNA(siRNA),合成互补的寡核苷酸链,构建重组腺病毒,鉴定目的基因.构建IKKβ基因过表达质粒,以与RNAi腺病毒质粒共同转染HEK293T细胞作为实验组,不转染任何质粒的细胞作为空白对照组,共转染过表达质粒和阴性对照病毒载体质粒的HEK293T细胞为阴性对照组,蛋白免疫印迹(Western Blot)方法检测各组HEK293T细胞中IKKβ基因表达.结果 成功构建IKKβ-RNAi腺病毒质粒及IKKβ过表达质粒,实验组IKKβ基因表达较空白对照组及阴性对照组下降,差异有显著性(t =49.18、44.648,P＜0.05).结论 构建的IKKβ-RNAi腺病毒质粒能有效抑制IKKβ基因表达,为进一步探讨肿瘤的生物治疗提供理论基础.

siRNA靶向沉默HIF-2对低氧微环境下胰腺癌细胞COX-2信号通路的影响

目的 观察体外乏氧条件下胰腺癌BXPC-3细胞中低氧诱导因子-2(HIF-2)和环氧合酶-2(COX-2)的表达,探讨HIF-2在低氧条件下对胰腺癌细胞COX-2信号通路的调控作用.方法 以CoCl2化学低氧法诱导肿瘤低氧状态,采用RT-PCR及Western blot方法分别检测低氧微环境下HIF-2、COX-2 mRNA和蛋白的表达.采用化学合成小干扰RNA(siRNA),转染BXPC-3细胞,进一步观察转染后HIF-2沉默对COX-2信号通路的影响.结果 在低氧条件下,BXPC-3细胞HIF-2 mRNA表达稳定,与常氧组比较,低氧8、24 h组HIF-2、COX-2mRNA表达均显著升高,差异有显著意义(F=529.49、63.99,q=8.99～46.02,P＜0.05),且低氧24 h组高于低氧8h组(q=20.40、6.97,P＜0.05);siRNA转染BXPC-3细胞后能够显著下调HIF-2、COX-2蛋白表达(F=243.98、63.99,q=8.99～30.69,P＜0.05).结论 低氧促使胰腺癌BXPC-3细胞HIF-2、COX-2 mRNA和蛋白水平表达升高,COX-2信号通路可能与HIF-2信号通路存在相互联系,并且共同促进胰腺癌的恶性进展.

CD59-siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用

目的 探讨针对CD59的siRNA(CD59-siRNA)对人卵巢癌裸鼠移植瘤CD59的沉默效应及其抑瘤作用.方法 采用脂质体转染法将CD59干扰质粒(T组)和空质粒(V组)转染A2780细胞,获得稳定表达细胞株,将T组、V组A2780细胞和未转染(C组)的A2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型,通过绘制肿瘤生长曲线、RT-PCR和免疫组织化学法研究其抑瘤效应和对CD59基因及蛋白的沉默效应.结果 与V组和C组比较,T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01～30.41,P<0.05),CD59基因及蛋白表达减少(F=817.77、247.71,q=26.59～52.25,P<0.05).结论 特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达及卵巢癌在体内的生长.

KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响

目的 探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性.方法 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF-7敲减KDR基因的表达.通过Hoechst 33258染色观察MCF-7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基化状态和mRNA的转录水平.结果 靶向KDR的siRNA转染MCF-7细胞后可诱导细胞凋亡,NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低,出现非甲基化条带,同时mRNA表达上调.结论 KDR siRNA在体外能逆转MCF-7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化,并诱导细胞凋亡.

靶向bcl-2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

目的 构建针对bcl-2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体,转染到bcl-2基因高表达的胃癌细胞株SGC-7901中,并筛选出稳定低表达bcl-2基因的细胞株.方法 针对bcl-2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列,插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中,经脂质体介导转染SGC-7901细胞.RT-PCR检测bcl-2基因在mRNA水平的变化, MTT 法检测bcl-2基因沉默后胃癌SGC-7901细胞的增殖情况.基因沉默效果好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株.结果 与对照组相比,转染成功后的细胞bcl-2基因在mRNA水平均显著下降, 细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆.结论 本研究成功利用针对bcl-2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl-2基因的SGC-7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础.

应用小干扰RNA技术阻断VEGF-C基因体内抑制乳癌细胞增殖

目的 应用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)阻断裸鼠乳癌移植瘤中血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因, 探讨其对人乳癌MCF-7裸鼠移植瘤生长的影响.方法 于雌裸鼠皮下种植MCF-7细胞,将成瘤阳性的裸鼠随机分为VEGF-C siRNA处理组、脂质体组和对照组,每组5只.VEGF-C siRNA处理组肿瘤局部注射VEGF-C siRNA 1 mg/kg和PEITM,脂质体组肿瘤局部注射PEITM和PBS,对照组仅注射PBS,每3 d注射1次,连续注射8次.22 d后拉颈处死全部动物, 取肿瘤,采用半定量 RT-PCR 分析VEGF-C mRNA水平,Western blotting检测VEGF-C蛋白表达水平.结果 VEGF-C siRNA处理组瘤组织的增长受到明显抑制,VEGF-C基因的mRNA和蛋白表达水平显著降低(F=73.64～197.15,q=8.74～25.56,P＜0.05).对照组各指标无显著变化.结论 化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内能成功下调人乳癌裸鼠移植瘤中VEGF-C基因的表达, 抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤基因治疗新方法.

抑制MCF-7乳癌细胞VEGF表达对树突细胞免疫功能影响

目的 探讨抑制MCF-7乳癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达对树突细胞(DC)免疫功能的影响.方法 针对VEGF基因设计小干扰RNA(siRNA),以脂质体转染法将 siRNA导入乳癌细胞MCF-7,RT-PCR 检测干扰VEGF基因后mRNA的表达,Western blotting法检测VEGF蛋白的表达,观察VEGF基因沉默效果.以MCF-7 乳癌细胞的培养上清和干扰VEGF基因后MCF-7 乳癌细胞培养上清液同时添加粒-单细胞集落刺激因子、白细胞介素-4、肿瘤坏死因子α培养正常异基因DC,利用MTT法和Hoechst33258检测DC刺激正常外周血T细胞增殖的能力及DC激发的细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤活性;ELISA法检测DC培养上清液中白细胞介素12(IL-12)及DC与外周血单个核细胞(PBMC)共同培养液中干扰素γ(IFN-γ)的含量.结果 VEGF基因经siRNA处理24 h后,MCF-7 乳癌细胞VEGF mRNA和蛋白的表达明显降低,其诱生的DC与MCF-7 乳癌细胞培养上清液诱生的DC相比, siRNA处理DC刺激T淋巴细胞增殖能力、CTL杀伤活性以及DC分泌IL-12和协同刺激外周血PBMC分泌INF-γ的能力明显增强.结论 siRNA可靶向抑制乳癌MCF-7 细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清液对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低.

短发夹 RNA靶向抑制EGFR基因对人卵巢癌Skov-3细胞凋亡和细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对卵巢癌细胞表皮生长因子受体(EFR)基因表达的影响及其效应.方法 体外合成EFR的DNA模板序列和pSilencer 2.1-U6neo质粒构建编码shRNA的表达载体,应用脂质体Lipofectamine 2000将其转染到人卵巢癌Sov-3细胞,采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学技术检测转染前后Sov-3细胞EFR基因的变化;采用AnnexinV/PI双染色标记的流式细胞仪检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞.结果 成功构建pSilencer-EFR短发卡状siRNA真核表达载体;靶向EFR的序列特异性的siRNA可以有效抑制Sov-3细胞EFR基因的表达;流式细胞分析显示,Sov-3细胞凋亡率明显增加,细胞周期出现明显的0/1期阻滞.结论 RNAi沉默EFR表达可以诱导卵巢癌Sov-3细胞凋亡,并使卵巢癌Sov-3细胞停滞在0/1期,RNAi可作为研究卵巢癌发生发展机制和基因治疗的有效工具.

靶向HPV18 E6基因不同锌指结构编码序列的siRNA对宫颈癌HeLa细胞作用的比较

目的 探讨靶向HPV18 E6基因不同锌指区编码序列的siRNA对HeLa细胞的影响.方法 分别设计靶向E6蛋白不同锌指区编码序列的两对siRNA,脂质体法转染HeLa细胞.半定量RT-PCR检测E6 mRNA转录表达水平;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞增殖活性;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况.结果 与siRNASCR转染组比较,RT-PCR结果显示,siRNA1和siRNA2转染后E6表达水平明显降低(F=8.709,P<0.05), 且siRNA2组较siRNA1组下降更为显著(t=3.61,P<0.05).MTT结果提示,2对siRNA转染后48 h和72 h的细胞增殖活性均明显下降(F=60.583、102.421,P<0.05),siRNA2组较siRNA1组下降更为明显(t=4.717、7.932,P<0.01);2对siRNA转染后均未检测到明显的细胞凋亡.结论 靶向锌指2区编码序列的siRNA抑制E6基因表达和HeLa细胞增殖的效果更好,锌指2区可能是使HeLa细胞发生恶性转化并使其增殖失调控的关键区域.

LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响

目的 探讨化学合成小干涉RNA(siRNA)对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性胃上皮(GT38)细胞LMP1编码基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖和凋亡的影响.方法 化学合成靶向LMP1 mRNA不同位点的3对siRNA,分别转染GT38细胞,选择干扰效果佳的siRNA进行实验研究,行RT-PCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析.结果 RT-PCR结果显示,3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达,以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果强.Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡.流式细胞分析显示,siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA649的靶细胞Bcl-2的表达水平降低.结论 靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达,进而可能通过抑制Bcl-2的表达诱导靶细胞凋亡.GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞.

RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

目的 构建表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA(siRNA)质粒,转染人卵巢癌细胞株skov3后检测RNA干扰(RNAi)对EGFR基因表达及细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 体外构建EGFR小发卡状RNA(shRNA)的表达质粒,脂质体法介导将其转染入skov3细胞.实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测EGFR mRNA的表达,使用免疫细胞化学法(ICC)检测EGFR蛋白的表达.使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定EGFR shRNA转染skov3细胞后细胞对顺铂敏感性的改变.结果 EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱(F=87.73,q=16.81、15.33,P＜0.01),EGFR蛋白表达明显下调(F=69.29,q=14.71、13.57,P＜0.01);顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍.结论 靶向EGFR基因的序列特异性shRNA可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达,增强skov3细胞对顺铂的敏感性.

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的 构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆.方法 采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16 E6基因的pSUPER.retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染入包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RT-PCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力.结果 获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RT-PCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制.细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降.结论 成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法.

siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用

目的 研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响.方法 利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGF mRNA的siRNA,通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC-7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照,用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化.结果 所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0/G1期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化.结论 体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达.

miRNA在HIV-1感染中的生物学功能

由人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染引发的艾滋病始终威胁着人类的健康和生命.根据联合国艾滋病规划署2012年新报道,2011年全球新发HIV感染者约为250万,170万人死亡,截至2011年末约有3 400万人忍受着艾滋病的折磨.非洲、撒哈拉一带仍然是全球感染严重的地区,感染率达到4.9％,约占总感染人数的69 ％[1].虽然全球总体艾滋病的防治措施已初见成效,但艾滋病防控工作依然任重道远.

细胞miRNA在HIV-1感染中的作用

RNAi下调LOX表达对人肺癌细胞乏氧转移的影响及其分子机制

目的 观察RNA干扰(RNAi)下调赖氨酸氧化酶(lysyl oxidase,LOX)表达对人肺癌细胞95D乏氧转移的影响及其分子机制.方法 应用针对人LOX基因的小干扰RNA( LOX siRNA)转染常氧(19％O2)95D细胞,24h后将细胞置乏氧(0.5％O2)培养箱孵育,乏氧24 h后采用实时PCR检测细胞LOX mRNA和Snail mRNA表达,Western blot技术评价Src、磷酸化Sre (P-Src Y418)和Snail蛋白表达,Transwell小室评价细胞侵袭能力.结果 与常氧95D细胞比较,乏氧引起细胞LOX mRNA表达和细胞侵袭能力分别增加14倍和2.12倍.与对照siRNA组比较,LOX siRNA转染使乏氧细胞LOX mRNA表达下降70％～75％,侵袭能力下降约30％,P-Src Y418和Snail蛋白表达降低约40％(P＜0.05),但不影响Src蛋白表达和Snail mRNA水平(P＞0.05).结论 LOX表达下调降低人肺癌细胞乏氧侵袭与减少Src活化和Snail蛋白表达有关,为LOX成为防治肺癌乏氧转移的潜在靶点提供了实验依据.

RNAi技术与肿瘤的基因治疗

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导,特异性降解相应序列的mRNA,致转录后水平基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)现象[1].近年来,RNAi的研究取得了很大进展,由于能作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命,并将彻底改变这个领域的研究步伐.2001年、2002年分别被美国杂志评为年度世界10大科学成就的第2名和第1名.

沉默低氧诱导因子-2α下调DLK1表达对乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤生长的影响

目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默低氧诱导因子-2α(hypoxia induciblefactor-2α,HIF-2αα)基因下调DLK1表达对乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)裸鼠移植瘤生长的影响.方法 建立BCSCs裸鼠移植瘤模型,原位注射RNAi慢病毒载体和空载体慢病毒载体至裸鼠左右侧背部移植瘤组织中,定期观察成瘤时间、瘤体体积及重量,进一步绘制生长曲线及计算抑瘤率.HE染色检测移植瘤组织病理,RT-PCR和Western blot法检测移植瘤组织HIF-2α、DLK1及CD44 mRNA和蛋白表达.结果 成功建立BCSCs裸鼠移植瘤模型.与空载体组相比,RNAi组移植瘤生长速率、瘤体体积和重量均明显降低(15.1％ vs 21.6％,5.80 cm3 vs 3.30 cm3,3.0 g vs 1.7 g,P＜0.05),抑瘤率为43.1％；HE染色显示RNAi组出现明显缺血坏死；RT-PCR结果提示RNAi组移植瘤组织中HIF-2α、DLK1及CD44蛋白表达均明显下调(0.59 ±0.02 vs 0.21 ±0.01,0.32 ±0.01 vs 0.08 ±0.01,0.76 ±0.03 vs0.04 ±0.01,P＜0.05)；Western blot结果也提示RNAi组移植瘤组织中HIF-2α、DLK1及CD44蛋白表达均明显下调(0.49 ±0.02 vs 0.28 ±0.01,0.43 ±0.02 vs0.11 ±0.01,0.62±0.03 vs 0.23±0.01,P＜0.05).结论 沉默HIF-2α基因下调DLK1表达有效抑制BCSCs裸鼠移植瘤生长,DLK1可能参与BCSCs未分化表型维持,并增强其致瘤性.

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的 探讨中期因子(midkine,MK)基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCCI、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达高者.采用MK siRNA转染乳腺癌细胞株,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察MK基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞粘附性,以Boyden小室方法检测癌细胞侵袭能力.结果 7株乳腺癌细胞中,MK均有不同程度的表达,以MCF-7细胞高;以MK siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞MK基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;siRNA转染组细胞粘附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降,均呈浓度依赖性(P<0.01;P<0.01).结论 MK基因在乳腺癌细胞粘附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞粘附和侵袭能力.