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Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定
目的:构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体.方法:根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序.结果:酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致.结论:成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础.
关键词： prohibitin基因 RNA干扰 shRNA 真核表达载体 -
靶向DAL-1基因的shRNA表达载体的构建与鉴定
目的:建立DAL-1稳定抑制的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞实验模型.方法:构建靶向DAL-1的shRNA表达载体转染NSCLC细胞株,筛选出阳性克隆,在mRNA和蛋白质水平鉴定其抑制效率,终得到DAL-1稳定抑制的细胞株.结果:通过双酶切鉴定和测序鉴定构建的shRNA表达载体序列正确,T4表达载体在mRNA和蛋白质水平能有效抑制DAL-1的表达,抑制率分别为(87.4±2.0)%和(82.7±2.1)%.结论:成功设计并构建了靶向DAL-1的shRNA表达载体,建立了DAL-1稳定抑制的NSCLC细胞株,为进一步研究DAL-1在NSCLC细胞中的作用提供了实验模型.
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慢病毒介导RNA干扰Cdh1的表达对大鼠脊髓损伤的修复作用
目的:观察大鼠脊髓损伤后皮层体感运动区Cdh1mRNA的表达变化,探讨慢病毒介导RNA干扰Cdh1的表达对脊髓损伤修复的作用.方法:15只雄性SD大鼠随机分成对照组和手术组,手术组采用Allen氏法建立脊髓打击损伤模型(T10～T11).荧光定量PCR检测脊髓损伤后大鼠体感运动皮层区Cdh1 mRNA表达变化.30只雄性sD大鼠随机分为A组、B组和C组,建模1 wk时分别注射生理盐水、空慢病毒和重组慢病毒.术后每周进行BBB评分,荧光定量PCR检测注射10 d后Cdhl mRNA的表达,损伤后6 wk同法注射BDA-TR,8 wk取脊髓冰冻切片.结果:手术组的Cdhl mRNA表达高于对照组(P＜0.05),注射药物10 d后C组Cdh1 mRNA表达低于A组及B组(P＜0.05).损伤6wk后C组运动功能评分均高于另两组(P＜0.05),且在脊髓空洞区可见更多神经纤维通过.结论:APC-Cdh1在抑制轴突生长方面可能起着重要的作用.
关键词： 脊髓损伤 细胞周期末期促进复合物 慢病毒 RNA干扰 -
Osteopontin特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及其在U251胶质瘤细胞中OPN的表达
目的:观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人胶质瘤细胞U251骨桥蛋白(osteopon-tin,OPN)表达的影响,为后续的以OPN基因为靶点的神经胶质瘤基因治疗研究奠定基础.方法:应用基因工程技术,筛选出2条针对OPN基因的RNAi靶序列,分别与pGCL-GFP载体连接,构建2个重组慢病毒表达载体LV-OPNshRNAl,LV-OPNshRNA2;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定.将LV-OPNshRNA,pHelper 1.0,pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将包装产生的2种重组慢病毒分别感染U251细胞,实时定量PCR和Western印迹检测U251细胞OPN mRNA和蛋白的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果:2个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×1010TU/L和5×1010TU/L.感染U251细胞后,OPN基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降.结论:成功构建针对OPN基因的2个慢病毒载体OPN shRNA,体外感染U251细胞后可有效抑制OPN基因和蛋白的表达.
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siRNA沉默P2X4表达对永生化小鼠小胶质细胞活化的抑制效应
目的:探讨特异性P2X4siRNA对永生化小鼠小胶质细胞活化的抑制效果.方法:体外培养永生化小鼠小胶质细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组、转染siRNA-F1组.空白对照组未进行任何干预;阴性对照组转染N control siRNA;转染siRNA-F1组转染先前筛选出来的1条特异性siRNA.3组细胞分别用50 μmol/L ATP刺激,采用激光扫描共聚焦显微镜检测胞内钙离子浓度([Ca2+];);P2X4R/OX42免疫荧光双标染色观察细胞形态.结果:转染siRNA-F1组ATP活化小胶质细胞后,胞内钙离子释放较阴性对照组和空白对照组减少;P2X4R/OX42免疫荧光双标染色显示转染siRNA-F1组细胞存在活化态小胶质细胞和静息态小胶质细胞,而空白对照组和阴性对照组只存在活化态小胶质细胞.结论:siRNA-F1能部分抑制永生化小鼠小胶质细胞的活化.
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逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响
目的:研究BNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1 si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFP si作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mBNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1 si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1 si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.
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RNAi抑制皮肤鳞癌A431细胞EGFR表达的实验研究
目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对皮肤鳞癌A431细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因表达的抑制作用及其对A431细胞增殖、凋亡的影响.方法:设计制备两对针对EGFR基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染A431人皮肤鳞癌细胞株,采用RT-PCR法检测EGFR mRNA的表达;Western Blot测定EGFR蛋白的表达;MTT法检测细胞生长的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:siRNA2干扰后EGFR mRNA与蛋白的表达强度分别为(16.5±1.6)%和(11.1±1.6)%,与对照组比较有统计学差异(P<0.05);在EGFR表达受到抑制的同时,转染后的A431胞生长速度明显变慢;A431细胞的凋亡率为(12.6±1.4)%,与对照组比较有统计学差异(P<0.05).结论:siRNA2能有效抑制皮肤鳞癌细胞EGFR基因的表达,抑制细胞的增殖,并促进细胞凋亡.
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人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定
目的:构建人Smad3的shRNA表达载体,运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达,观察对肿瘤细胞生长的影响. 方法:化学合成针对人Smad3基因的dsRNA,瞬时转染入Hela细胞,检测RNA干扰效果,筛选有效干扰靶位点;设计并合成针对人Smad3基因的siRNA寡核苷酸链,经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencerTM3.1-H1 hygro,转染入Hela细胞,用hygromycin B筛选稳定单克隆细胞株,对细胞株行RT-PCR和Western Blot检测,观察siRNA对靶基因的抑制效果,进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化. 结果:瞬时转染筛选到了有效的RNA干扰靶位点,构建载体后,建立稳定转染的单克隆细胞株,Smad3 mRNA和蛋白质水平均显著下调,导致肿瘤细胞生长抑制. 结论:成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调Smad3的表达,为进一步研究Smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础.
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利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用
目的:利用siRNA抑制β TC-3细胞中胰岛素受体基因的表达.方法: 化学合成胰岛素受体(IR)基因的4对特异siRNAs(实验组:siRNA-1组,siRNA-2组,siRNA-3组,siR-NA-4组)和1对非特异siRNA(NC组).通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染β TC-3细胞,24 h后荧光显微镜下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率;应用逆转录PCR检测IRmRNA表达.结果: ①50,100,150,200 nmol/L siRNA转染βTC-3细胞24 h后,转染效率分别为(73.1±4.1)%,(92.9±3.4)%,(90.8±4.0)%,(93.9±2.8)%,选择190 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度.②转染100 nmol/L siRNAs 24 h后,与对照组相比siRNA-1,2,3,4组B TC-3细胞IR mRNA表达都有不同程度下调,其中以siRNA-2组抑制效果为明显,表达减少了70.5%.结论: 靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达,为进一步研究β细胞上IR的功能提供了实验基础.
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RNAi抑制NEK293细胞TGF-β1表达的研究
目的:探讨针对转化生长因子β1(TGF-β1)的小干扰RNA(siRNA)对大鼠肾间质细胞系(NEK293)TGF-β1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用.方法: 利用RNA干扰(RNAi)效应设计针对TGF-β1的不同siRNA,构建表达载体质粒并转染NEK293细胞系.RT-PCR和WesternBlot分别检测TGF-β1 mRNA及蛋白的表达,细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化.另设一无意义RNA载体质粒为阴性对照.结果: siRNA转染效率70%,特异性siRNA对TGF-β1 mRNA及蛋白的表达具有抑制作用(P>0.05),实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加(P>0.05).结论: 应用RNAi技术可明显抑制TGF-β1的表达,并高效的抑制NEK293的生长、诱导其凋亡.
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Survivin shRNA真核表达载体的构建及其生物学作用
目的:构建存活素(survivin)基因短发夹RNA(shR-NA)的表达质粒,为乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.方法: 设计并合成有小发夹结构的8条survivin shRNA对应模板序列,退火并与pShuttle 1.0-CMV载体重组质粒;将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF-7;MTT实验筛选出有效质粒及其有效浓度,流式细胞术检测细胞周期的变化,经Hcechst染色观察凋亡情况,RT-PCR和Westem Blot检测survivin基因的表达情况.结果: 成功构建重组质粒并筛选出有效质粒及其有效浓度;细胞受阻于G2/M期,并通过荧光染色发现有凋亡细胞;survivin基因表达受到抑制.结论: 构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达,这为研究乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.
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针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用
目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.
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siRNA干扰ADAR1表达对小鼠混合淋巴细胞培养的影响
目的:研究靶向ADAR1基因的siRNA在小鼠双向混合淋巴细胞培养中所扮演的角色. 方法:将化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA在Lipofectamine 2000介导下转染处于双向混合淋巴细胞培养试验中的小鼠淋巴细胞,观察转染组与未转染组细胞表型的变化;通过RT-PCR检测两组细胞中ADAR1 mRNA的变化;细胞计数和台盼蓝拒染法检测靶向ADAR1基因的siRNA对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法评价转染化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA后对小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用. 结果: 在经典淋巴细胞混合培养试验中,转染靶向ADAR1基因的siRNA可以明显降低小鼠淋巴细胞内ADAR1的表达,同时ADAR1-siRNA对小鼠淋巴细胞的增殖有抑制作用. 结论:在经典淋巴细胞混合培养试验中,化学合成的靶向ADAR1基因的siRNA能有效抑制ADAR1基因在小鼠淋巴细胞中的表达,并对小鼠淋巴细胞增殖有抑制作用.
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PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响
目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率高,可达93.99%. HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P＜0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率高,为66.91%. 结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.
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间皮素RNAi重组慢病毒载体的构建和鉴定
目的:针对间皮素(MSLN)构建RNAi重组慢病毒质粒并用慢病毒包装,探讨MSLN功能.方法:根据MSLN基因信息,用慢病毒质粒载体pRNAT-U6.2/Lenti构建了三个携带小干扰序列和一个阴性对照序列的重组质粒,转染OVCAR-3细胞后,检测RNA干扰效率,选择干扰效率高的质粒载体进行慢病毒包装,并检测病毒滴度,用慢病毒感染细胞再次检测RNA干扰效率和对细胞粘附功能的影响.结果:测序结果证明四种质粒载体的插入序列完全正确.脂质体转染重组慢病毒质粒pRNAT-siRNA3的RNA干扰效率高,为67.5%.鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度为1×108ifu/mL.pRNAT-siRNA3慢病毒感染细胞的mRNA干扰效率为78%,pRNAT-siRNA3慢病毒干扰组细胞粘附率为(15.1±1.3)%明显低于阴性对照组(33.4±8.2)%和空白对照组(30.0±5.8)%,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:pRNAT-siR-NA3慢病毒的感染能显著抑制OVCAR-3细胞MSLN表达以及粘附能力.MSLN RNAi重组慢病毒质粒载体的制备成功为进一步研究MSLN功能和用慢病毒进行基因治疗建立了一个良好的平台.
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siRNA沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡、周期及增殖的影响
目的:观察沉默livin基因对恶性黑素瘤LiBr细胞凋亡和周期及增值的影响.方法:采用siRNA-3转染人恶性黑素瘤LiBr细胞后分别应用TUNEL法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用免疫荧光细胞化学技术检测siRNA对凋亡效应蛋白Caspase-3表达的影响及应用MTT法检测siRNA对细胞增殖的作用.结果:siRNA-3转染LiBr细胞72h可诱导细胞凋亡(P＜0.05)和引起细胞GO/Gl期阻滞(P＜0.05);可下调Caspase-3蛋白表达(P＜0.05)及抑制细胞增殖(P＜0.05).结论:Livin可做为应用RNA干扰技术探索恶性黑素瘤基因治疗的潜在靶基因.
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胃癌组织中mdm2和Rb基因表达及临床意义
目的:探讨mdm2,Rb基因表达与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系.方法:采用免疫组织化学技术(S-P法)检测18例正常胃黏膜、26例异型增生胃黏膜、18例早期胃癌、38例进展期胃癌患者组织中的MDM2,Rb基因蛋白的表达情况,并与临床病理特征相比较.在此基础上,我们通过RNAi技术特异性降低mdm2的表达水平,观察细胞周期的变化,探讨了mdm2作用的分子机制.结果:MDM2蛋白在正常胃黏膜、Ⅰ型及Ⅱ型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的阳性表达率分别为33.3%,40.0%,43.8%,55.6%,57.9%.Rb蛋白的阳性表达率分别为94.4%,100.0%,81.3%,55.6%,63.2%.随着胃黏膜病变的进展,MDM2表达率逐渐增高,在进展期胃癌中达到高峰,但各组间相比差异无统计学意义(P＞0.05).Rb的表达呈相反的趋势,在Ⅰ型增生中表达高,到进展期胃癌时表达低.在Ⅰ型增生胃黏膜中的表达率与早期胃癌、进展期胃癌相比,差异均有统计学意义(P均＜0.05).MDM2蛋白表达与胃癌淋巴结转移、浸润深度有关.Rb蛋白表达与胃癌临床病理学相关指标间无关.MDM2和Rb在胃癌中的表达呈负相关(P＜0.01,γs=-0.475).干涉mdm2后可以明显抑制细胞的增殖.结论:MDM2,Rb的表达可作为判断胃癌生物学行为的一个指标,对预后有一定的指导意义;特异性降低mdm2的表达可以作为胃癌治疗的一个分子靶点.
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携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备
目的:构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体.方法:将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA(VEGF165)片段插入载体质粒pSNAV2.0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2.0-EGFP-U6-shRNA(VEGF165).以HSV1-RapCap/△UL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒.对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测.结果:PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98%以上.点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×1014 v.g.(vector genomes)/L. EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30%以上.结论:成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF165)病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础.
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EB病毒LMP1基因靶向shRNA表达载体构建方法的比较研究
目的:探讨两种构建EB病毒LMP1 基因的shRNA表达载体(pshLMP1)方法的不同,寻找更加稳定方便的靶向shRNA表达载体的构建方式.方法:设计针对EB病毒LMP1基因的特异siRNA 编码序列,分别应用传统的双链退火法和新颖的双链PCR法构建pshLMP1,比较两种方法在设计原则、构建方法和鉴定结果上的不同.结果:两种方法均能得到pshLMP1重组质粒,但是双链PCR法构建效率高且不易引起碱基的缺失和突变.结论:双链PCR法构建EB病毒pshLMP1表达载体比传统双链退火法更加稳定,构建成功率较双链退火法高.
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shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制
目的:重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用.方法:根据MDR1基因序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列(sh-MDR1-1,sh-MDR1-2),重组构建psh-MDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC-7721/R,用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的潴留.结果:PCR和DNA测序证实了psh-MDR1-1和psh-MDR1-2重组质粒的成功构建,均能有效地抑制细胞P-gp表达;转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性,P-gp表达水平明显降低,细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高;第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论:体外完成shRNA RNAi载体的构建,能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达,抑制P-gp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi,能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.
