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细粒棘球蚴和多房泡球蚴在人体内蛋白质表达谱初步分析
目的 初步掌握流行于青海省细粒棘球绦虫幼虫棘球蚴(原头节、囊壁、囊液)和多房棘球绦虫幼虫泡球蚴在中间宿主人体内蛋白质表达情况.方法 利用SDS-PAGE和Western-blot分析棘球蚴原头节、囊壁、囊液蛋白质和泡球蚴总蛋白表达谱.结果 细粒棘球蚴原头节的蛋白质浓集在分子量72 kDa处,囊壁的蛋白质浓集在72 kDa、26 kDa和17 kDa处,囊液的蛋白浓集在72 kDa、43～55 kDa、26 kDa和17 kDa;泡球蚴总蛋白质浓集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa处.结论 不同地区细粒棘球蚴在人体内蛋白的表达存在差异;不同亚种泡球蚴原头节蛋白的表达存在差异.
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基于线粒体12S基因对青藏高原细粒棘球蚴种群遗传结构的研究
目的 分析青藏高原细粒棘球蚴的种群遗传结构,为细粒棘球蚴病的防控提供基础资料.方法 对采自青藏高原来自不同地区(青海、西藏、四川)不同宿主(人、绵羊、牛)的58株细粒棘球蚴进行了线粒体12S基因的全序列测序,结合已报道的青海地区42个细粒棘球蚴绵羊株的12S全序列进行种群遗传结构分析.结果 本次研究56个分离株鉴定为Echinococcus.granulosus sensu stricto(基因型G1–G3);分析98个青藏高原地区分离株12S序列,包含15个核苷酸变异位点,共检测出13个单倍型(ES1～ES13),单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.381、0.00092.3个地域种群中,四川种群的核苷酸多样性高(0.001353),种群内遗传距离大(0.00135).分子变异分析(AMOVA)显示,种群内的遗传变异大于种群间的遗传变异.构建单倍型NJ树和贝叶斯树显示,ES10和ES11形成一个有别于其他单倍型的单倍型类群.单倍型网络显示,单倍型ES1是优势单倍型,其它单倍型围绕它成辐射状,未发现有地理聚类.基因流(Nm值)和遗传分化指数(FST值)显示各地域种群间未形成显著的遗传分化.结论 青藏高原细粒棘球绦虫的基因型为G1-G3型;青藏高原细粒棘球绦虫种群内及种群间都存遗传多样性,其中四川种群的遗传变异性大;青藏高原细粒棘球绦虫种群内变异是种群变异的主要来源;种群未形成地理聚类,遗传分化不明显.
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我国细粒棘球绦虫新疆分离株AgB8/3亚基克隆表达及其检测囊型包虫病价值分析
目的 评价重组细粒棘球蚴AgB8/3亚基检测囊型包虫病价值.方法 从新疆源细粒棘球蚴原头节中提取总RNA,通过RT-PCR扩增目的基因片段并克隆入pGEX-3X表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,IPTG诱导表达,用亲和层析法纯化重组蛋白,用ELISA方法评价其诊断价值并与本课题组制备的重组AgB8/1和AgB8/2进行比较.结果 酶切鉴定及测序分析表明,成功构建细粒棘球蚴pGEX-3X-AgB8/3重组质粒,并在原核细胞用IPTG成功诱导目的蛋白表达.rAgB8/3检测囊型包虫病患者血清的敏感度为55.9％(66/118)；检测泡型包虫病患者血清阳性率为44.12％(15/34)；59份其它寄生虫病患者血清中除3份囊尾蚴病人血清阳性外,其他均为阴性；50份健康者血清全部为阴性,总特异度为87.4％(125/143).rAgB8/3检测的敏感度与rAgB8/1相当(P＞0.05)而低于rAgB8/2 (P＜0.05)；rAgB8/3检测的特异度与rAgB8/1和rAgB8/2均无统计学差异(P＞0.05).结论 成功构建新疆源细粒棘球蚴pGEX-3X-AgB8/3重组质粒并在原核细胞表达,rAgB8/3检测囊型包虫病结果与rAgB8/1无统计学差异.
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定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达
目的 在已构建的氧化胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库中,筛选细粒棘球蚴在抗氧化过程中差异表达的重要基因.方法 将前期研究中应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建氧化胁迫下细粒棘球蚴差异表达基因的消减cDNA文库进行蓝白斑筛选和菌落PCR分析后测序分析.测序结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析.从文库中随机挑选4个未知新序列和抗氧化密切相关的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化胁迫下,差异表达基因片段在mRNA水平上的变化情况.结果 整个文库克隆测序结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等.另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因.定量PCR结果显示:S88、H32-1 两个基因在0.8 mmol/L H_2O_2氧化胁迫的原头蚴中表达量分别上调为未经氧化胁迫原头蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段当H_2O_2浓度大于0.8 mmol/L时,其表达量增高.结论 上述基因的上调表达很可能与细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关功能有密切的联系,可以作为研究细粒棘球蚴抗氧化的候选基因.
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应用SSH技术研究H2O2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达
目的 构建H2O2胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库.方法 以H2O2胁迫细粒棘球蚴cDNA为试验方(tester),正常生长的细粒棘球蚴cDNA为驱动方(driver),应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)研究H2O2胁迫下细粒棘球蚴基因的表达.结果 文库扩增后得到124个阳性克隆,菌落PCR分析,均得到200～1 000 bp插入片段.将整个文库克隆进行测序,测得序列结果 利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析.结果 获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等.另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因.结论 成功构建了H2O2胁迫与正常组织差异表达的消减cDNA文库,为研究细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关靶基因筛选奠定基础.
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肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁钙化分布及意义
目的 研究肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁(外囊)的钙化分布特征并探讨其意义.方法 应用特殊染色观察60例肝细粒棘球蚴外囊壁病理形态特点及钙盐沉着的分布特征,并结合病人血清生化指标及CT观察结果 进行分析.结果肝细粒棘球蚴外囊壁中钙盐沉着集中分布于近虫体侧内层纤维性囊壁,且形态各异,与近肝侧外层纤维性囊壁比较有显著差异(P＜0.05);病人血清钙代谢生化指标均为常值,钙化与非钙化组比较均无显著差异(P均＞0.05);染色可见部分CT未见钙化的囊壁有钙盐沉着.结论 肝包虫周围纤维性囊壁可分为内层和外层,且各自形成机制不同;钙盐沉积量与内层纤维囊壁形成进程有关.
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细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究
目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus Eg)铁蛋白(ferritin)基因的原核表达重组质粒并表达、纯化该重组蛋白,初步研究其免疫反应.方法将细粒棘球蚴铁蛋白基因亚克隆于表达载体pGEX-6p-1,转化重组体到大肠杆菌Bl21中,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达;用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行初步鉴定,用切胶纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,通过Western-blot对该蛋白的免疫学特性进行初步研究.结果重组铁蛋白与GST以融合表达的形式在细菌中高效表达,表达产物为不可溶性的包涵体,蛋白分子量约为42 kD.融合蛋白Egferritin/GST能被细粒棘球蚴免疫的家兔血清和特异性小鼠抗血清所识别,同时特异性小鼠抗血清可识别天然抗原囊液、原头蚴可溶性蛋白中约19 kD的蛋白条带.结论成功地表达细粒棘球蚴重组铁蛋白,并且该蛋白有一定的免疫原性及抗原性.
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细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析
目的获得细粒棘球蚴EG95基因序列资料,进行序列分析,为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础.方法 从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces),提取RNA和DNA,用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因;并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析.结果以基因组为模板获得一个基因,长度为1253bp,以cDNA为模板获得两个基因,长度分别为1121bp和833bp;同源性比较结果表明:来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG95-2基因同源性为98%,有13个碱基变异;从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同,只是EG95序列的一部分;从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG95-2同源性为99%,有2个碱基不同.分析表明EG95是一个基因家族,可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因.结论 EG95是一个基因家族,进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义.
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细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建
目的克隆Eg95抗原基因,构建携带目的基因的真核表达载体,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料.方法应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因,将其克隆至pUCm-T载体,测序确定其正确性.利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列.结果测序表明所选pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒,可以作为DNA疫苗作进一步的研究.结论成功构建真核细胞表达载体pcDNA3-Eg95.
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细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定
目的分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA（3'和5'端,尤其是基因的5'非翻译区）。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库,筛选全长目的基因,研究其结构和功能。方法采用TRIZOL试剂提取E.granulosus总RNA,用ClonTech公司的SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建E.granulosus原头节全长cDNA文库,文库的包装使用EICENTER TECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库，文库滴度为1.4×107 pfu/ml。文库的重组效率达到99%以上,插入片段长度约为1.1kb。
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囊型包虫病诊断抗原研究进展
随着分子生物学技术的发展,用基因工程技术制备的Eg重组抗原是目前研究的热点.1 AgBAgB是细粒棘球蚴釀液中的一种分子量为120~160kDa的耐热脂蛋白,是具有高度免疫原性,并被认为是目前用于免疫诊断试验中具有较高敏感性和特异性的抗原之一.
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免疫胶体金渗滤法快速诊断试剂盒对包虫病患者血清的检测
囊型包虫病又称囊型棘球蚴病,是人类感染细粒棘球绦虫的幼虫(细粒棘球蚴)所致的一种慢性寄生虫病,棘球蚴可以寄生在人体的任何部位.医学影像学是目前诊断本病的可靠方法.血清抗体的检测也有一定的诊断价值.我院从1999-2003年共有24例经彩超诊断和手术证实的囊型包虫病患者,现将采用新疆兆丰生物技术工程公司生产的免疫胶体金渗滤法--快速诊断试剂盒检测这些患者血清的结果见表1:
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4种免疫原对棘球绦虫继发性感染的预防效果
由于猪带绦虫和细粒棘球绦虫间存在大量的共同抗原[1～3],为寻找可能的免疫原制备细粒棘球绦虫疫苗,我们将4种猪带绦虫和细粒棘球绦虫抗原进行了初步免疫预防的动物实验,现将结果报告如下1 材料与方法1.1 免疫原制备 E.gCF免疫原:细粒棘球蚴囊液采绵羊肝脏,离心上清液浓缩20倍透析即E.gCF免疫原.E.gPS免疫原:离心沉淀洗涤数次,超声粉碎20min,离心收集上清液即E.gPS免疫原.C.cCF免疫原:猪囊蚴囊液离心收集上清液即C.cCF免疫原.C.cSW免疫原:猪囊尾蚴的头节和囊壁,洗涤数次后匀浆超声粉碎20min,离心收集上清液即C.cSW.分光光度法测定蛋白含量(751G).
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细粒棘球蚴重组抗原rEgferritin诱导宿主抗感染免疫应答的初步研究
目的 初步探讨细粒棘球蚴重组铁蛋白rEgferritin免疫小鼠产生的抗细粒棘球蚴感染的免疫机制.方法 rEgferritin免疫ICR小鼠3次、同时设立佐剂组和对照组,第12w用细粒棘球蚴原头蚴对3组小鼠进行攻击感染,5个月后剖杀小鼠,检查各组小鼠腹腔内包囊个数,根据公式计算保护力.分别于0w,12w,32w取血,制备血清,同时取脾,制备淋巴细胞悬液.通过ELISA检测血清中的IgG及其抗体亚型、IgE及MTT；通过流式细胞仪检测脾淋巴细胞中CD;及CDf亚群百分比.结果 rEgferritin组小鼠血清中的IgG,IgG2a,IgG2b持续增高,与佐剂组相比具有显著性差异(P＜0.01)；3组IgG3无差异.rEgferritin组免疫小鼠可诱导小鼠产生85.6％的保护力抵御细粒棘球蚴原头蚴的再次感染,与对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)；rEgferritin组和佐剂组CD4+ T细胞和CD+T细胞均增加,rEgferritin组CD;T细胞增加更为明显,与佐剂组相比有显著性差异(P＜0.01).rEgferritin组脾细胞在受到rEgferritin抗原和天然抗原刺激后,细胞增殖明显.结论 细粒棘球蚴重组抗原rEgferritin通过诱导宿主产生体液免疫级细胞免疫应答的方式抵御细粒棘球蚴感染的,说明rEgferritin是具有研究价值和潜力的包虫病候选疫苗分子.
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湖北省宜昌市首例肝包虫病治疗及调查报告
包虫病又称棘球蚴病,是棘球绦虫的幼虫寄生在人体内引起的疾病.在我国有两种,即细粒棘球蚴引起的囊型包虫病和由多房棘球蚴引起的泡型包虫病.包虫病是我国北方和西南地区危害人畜的重要寄生虫病,属法定丙类传染病[1].2009年3月湖北省宜昌市第一人民医院报告1例肝包虫病临床诊断病例,宜昌市疾病预防控制中心接到报告后,立即进行了流行病学调查,现将调查结果报告如下.
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细粒棘球蚴抗原B对体外培养人外周血单个核细胞中Th17细胞的影响
目的 观察细粒棘球蚴抗原B(AgB)对体外培养人外周血单个核细胞(PBMC)中CD4+ IL-17+T细胞(Th17)细胞的影响.方法 Ficoll法分离健康人群外周血中的PBMC并接种于24孔培养板,分为阴性对照组、低剂量抗原B(2 mg/L)实验组和高剂量抗原B实验组(5 mg/L)进行培养.分别在培养96、120和144 h后取样,通过流式细胞术(FCM)检测培养液中Th17细胞的阳性表达率.所得结果采用两组配对t检验.结果 Th17细胞的阳性表达率在低剂量和高剂量抗原B干预培养96 h后分别为0.433±0.115和0.500±0.265,较阴性对照组1.067±0.473均降低,差异有统计学意义(P＜0.05),而在120 h和144h虽有降低趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 细粒棘球蚴抗原B对健康人外周血单个核细胞中Th17细胞的表达具有抑制作用,它可能与细粒棘球蚴所致免疫逃避机制有关.
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胆汁对体外细粒棘球蚴原头节的作用
目的 探究不同浓度的胆汁在体外对细粒棘球蚴原头节生长的影响.方法 体外培养绵羊细粒棘球蚴原头节,将不同浓度的胆汁作用于原头节.0.1％伊红染色在倒置显微镜下检测原头节的活力.实验重复3次.结果 不同浓度的胆汁对原头节均有杀伤作用.浓度为100％和80％的胆汁对细粒棘球蚴原头节杀伤作用明显,其中100％的胆汁在作用于原头节4d后死亡率就可达到100％.各浓度的胆汁与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 胆汁对体外细粒棘球蚴原头节有抑制作用,而关于胆汁在体内的疗效有待于进一步研究.
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铁筷子多糖联合阿苯达唑抑制小鼠细粒棘球蚴生长
目的研究中药铁筷子多糖单独及联合阿苯达唑用药对小鼠继发性感染细粒棘球蚴的抑制作用,探讨其作用的机制及寻找药物治疗细粒棘球蚴病的新途径.方法动物实验共分 4组:阿苯达唑组;铁筷子多糖组;铁筷子多糖+阿苯达唑组;对照组.对小鼠继发性感染细粒棘球蚴病药物治疗 90d后,检测各组小鼠棘球蚴囊湿重;并进行病理组织学和超微结构观察.结果铁筷子多糖、阿苯达唑及联合用药组均有抑制小鼠棘球蚴生长的作用(抑囊率分别为 38.23%, 64.86% 和 77.54%),其中联合用药组明显优于单独用药组( P< 0.05).病理组织及超微结构观察发现各治疗组中棘球蚴囊壁组织和细胞均有不同程度的改变或破坏.结论铁筷子多糖对小鼠棘球蚴生长有一定的抑制作用,与阿苯达唑联合治疗效果更佳,这可能与铁筷子多糖提高小鼠机体的免疫力有关.联合用药是提高阿苯达唑驱虫效果的有效途径之一.
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细粒棘球蚴Eg95全长基因的克隆与在甲醇酵母中的表达
目的了解我国新疆细粒棘球绦虫表膜蛋白Eg95的全长基因结构及尝试其在甲醇酵母中表达.方法PCR从细粒棘球蚴头节DNA中扩增含有全长编码区序列(cds)的基因,克隆到T载体中测序.再亚克隆到pMETαA中,构建不带6个组氨酸标签的重组质粒,转化甲醇酵母,分析Eg95全长基因的表达.结果成功扩增了细粒棘球蚴绦虫1262bp的Eg95全长基因,含有两个内含子,外显子核苷酸序列与Genbank中细粒棘球绦虫Eg95 cds完全一致,但扩增的基因与已知的其他Eg95全长基因存在差别.1μg重组质粒的表达盒转化甲醇酵母PMD16,获得了Eg95基因重组工程酵母10个,其中非同源重组子3个.甲醇诱导非同源重组酵母特异表达出了分子量约为17kDa与Eg95cds编码蛋白接近的蛋白.酵母培养上清SDS-PAGE未见该蛋白条带出现,表达的蛋白可能主要位于酵母表面.结论克隆到Eg95属于一个基因家族的成员之一,其基因编码区高度保守,含有内含子的全长基因同样可在酵母中进行表达.
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细粒棘球蚴AgB亚单位基因的联合表达和血清学评价
目的 为进一步提高AgB抗原在诊断中的敏感性和特异性,将细粒棘球蚴AgB1和AgB2两个亚单位基因在同一载体中进行联合表达,并对联合表达的重组抗原和单基因表达的AgB1、AgB2在血清抗体检测中的差异进行比较研究.方法 在表达载体PET32a中构建AgB1+AgB2(AgBs)联合基因的重组质粒,用ELISA检测重组抗原与病人血清的反应性.结果 构建了AgBs重组质粒,经测序证实插入的联合基因片段序列正确.AgBs重组质粒表达的融合蛋白分子量为38 kDa,为不溶性蛋白.联合表达抗原AgBs对细粒棘球蚴病(CE)血清的敏感性为84.4%,特异性为80.5%;单基因表达的AgB1和AgB2的敏感性分别为75.6%和57.8%,特异性分别为72.6%和91.2%.结论 成功构建了AgB亚单位联合表达基因,联合表达的AgBs抗原对CE血清的诊断价值优于单基冈表达的AgB1或AgB2抗原.
