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食管癌组织中Caspase-8表达及临床意义
目的 研究食管癌组织中半胱氨酸蛋白酶8(Cagpase-8)基因表达及其与临床参数的关系.方法采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫组化染色法检测96例食管癌患者的食管癌组织和癌旁正常组织Caspage-8表达.结果 与正常组织比较,食管癌组织中Cagpase-8 mRNA表达者57%下调(P<0.05);食管癌组织Cagpase-8蛋白表达显著低于配对的正常组织;Csspase-8 mRNA表达水平与淋巴结转移、家族史、肿瘤体积、肿瘤分期和肿瘤位置有关(P<0.01,<0.05),Cagpase-8蛋白表达水平与淋巴转移、肿瘤体积和肿瘤分期有关(P均<0.05).结论 Csspsse-8在食管癌发展中起重要作用,对食管癌病情进展的监测、转移潜能及预后估计等具有潜在价值.
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用TaqMan探针法对乙型肝炎病毒进行定量及分型研究
目的 评价实时定量聚合酶链反应(PCR)方法在乙型肝炎病毒(HBV)定量和基因分型应用中的检测灵敏度、动力学(定量线性)范围、重复性、精(准)确性及其对基因型分析的能力.方法 从罗氏公司购置标准品、引物及Taq-Man探针试剂.选取HBV感染者的血清和肝细胞标本,用定量PCR法对HBV 7个基因型(A-G)进行检测及定量研究;对模板进行连续的梯度稀释用于验证本试验体系的敏感性、动力学(定量线性)范围及精(准)确性.结果 和结论此方法能够对HBV 7个(用于HBV的定量和基因分型)基因型进行定量.该方法的检测底线(限)为50拷贝/ml,定量线性范围从100拷贝/ml至109拷贝/ml,同时具有很高的重复性和精确性.
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荧光SYBR Green I染色及银染方法在定量聚合酶链反应诊断21-三体综合征中的比较
目的比较SYBR Green I染色及银染方法在定量聚合酶链反应(Q-PCR)诊断21-三体综合征(21-三体)中的优劣.方法 PCR扩增26例21-三体及20例正常人DNA,分别用琼脂糖电泳-SYBR Green I染色及聚丙烯酰胺凝胶-银染方法检测,进行光密度定量分析及比较.同时以细胞遗传学核型分析作对照.结果两种方法检测DNA均于24个PCR循环时显带清晰;定量分析结果同核型分析结果一致;SYBR Green I染色历时30 min,而银染则历时4～5 h.结论在Q-PCR中SYBR Green I染色敏感度同银染,较银染更简单、省时、经济.
关键词： SYBR Green I 银染 定量聚合酶链反应 检测 21-三体综合征 -
极限稀释法对急性淋巴细胞白血病IgH和Vδ2Dδ3基因重排的定量检测及其意义
目的探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)IgH和Vδ2Sδ3基因重排微小残留病(MRD)值在判断预后的意义.方法运用极限稀释法对ALL完全缓解期(CR)后不同时期的骨髓标本进行IgH和Vδ2Dδ3基因重排的定量检测.结果24例初诊时存在IgH或Vδ2Dδ3基因重排的ALL患者CR后不同时期51份骨髓标本中,MRD＞0.1%者3例,其中2例复发,1例失访,复发率为75%.MRD为0.002%～0.1%者6例,1例复发,复发率为17%.MRD＜0.002%者15例,无复发.复发组3例MRD均值为0.239%,未复发组20例MRD均值为0.004%.复发组MRD明显高于未复发组,P＜0.05.结论 ALL时IgH和Vδ2Dδ3基因重排的定量检测的MRD增高,则病人的复发危险率随之增高.加强化疗后化疗药物对白血病细胞的杀伤效应使MRD减少,CR后MRD定期监测对指导化疗药物的选择、观察疗效、判断预后有指导意义.
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慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA定量检测与抗原抗体模式的关系
目的探讨慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量与抗原抗体模式的关系,为慢性乙型肝炎的诊治及预防提供科学依据.方法采用荧光标记定量聚合酶链反应和酶联免疫吸附实验法检测180例慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA含量和抗原抗体,统计分析不同抗原抗体模式HBV DNA含量.结果在HBsAg和HBeAg同时阳性模式中,HBV DNA含量＞103 copy*ml-1者114例(91.20)%,其中＞107 copy*ml-1者44例(35.20%);在HBsAg和抗-HBe同时阳性模式中,HBV DNA含量＞103 copy*ml-1者18例(56.25%),其中＞107 copy*ml-1者4例(12.50%).HBeAg阳性模式HBV DNA含量显著高于HBeAg阴性模式(Ρ＜0.01).结论 HBeAg阳性模式HBV DNA含量高于HBeAg阴性模式,HBeAg阳性模式中少数人HBV DNA含量很低,HBeAg阴性模式中少数人HBV DNA含量很高.仅根据抗原抗体模式,难以准确地判断病毒复制程度及传染性的强弱.
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实时荧光定量聚合酶链反应检测杜氏盐藻突变株中硝酸盐还原酶基因的表达
目的 分析获得的2株杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)突变藻株(M1和M2)中NR基因的表达情况.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法,以管家基因β-actin作为内参,进行相对定量检测比较NR基因的表达变化.结果 盐藻突变藻株NR基因相对表达量明显低于野生型杜氏盐藻.所分离的杜氏盐藻NR突变藻株中确实存在NR基因的突变.结论 本研究为终利用NR基因作为选择标记,建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定了实验基础.
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无症状HBsAg携带者血清HBV DNA定量检测的评估
目的探讨一种新的高灵敏度血清HBV DNA水平检测方法以及病毒DNA检测用于献血员筛选的可行性.方法采用AmpliSensor定量荧光PCR技术定量检测经ELISA法筛选的321名健康志愿者和37名HBsAg携带者血清HBV DNA水平.结果321名志愿者中2名HBV DNA阳性(0.6%);37例HBsAg携带者DNA检出率100%,但DNA含量相差较大(7.98±5.37).结论AmpliSensor定量荧光PCR技术灵敏度可达对数值1拷贝/毫升,该法用于献血员病毒DNA检测有一定意义,但更适合用于临床健康检查;同时发现HBV在无症状HBsAg携带者体内病毒复制差异较大,可能与不同个体的免疫状况有关.
关键词： 乙型肝炎病毒表面抗原 定量聚合酶链反应 -
乙型肝炎患者外周血单个核细胞内HBV DNA定量检测及其意义
目的:探讨慢性乙型肝炎患者血清、肝组织、外周血单个核细胞(PBMC)中病毒载量的相互关系;初步明确PBMC病毒量与肝细胞损伤之间的关系.方法:50例慢性乙型肝炎患者均接受肝活检.一部分肝穿标本进行常规病理检查,另一部分用于HBV DNA定量检测.同时分离患者PBMC,用于病毒载量分析.病毒定量采用荧光定量PCR技术.同时收集患者的生化检查资料.通过SAS 8.0软件对相关数据进行统计分析.结果:PBMC中HBV DNA载量与肝组织HBV DNA载量呈中度正相关(r=0.53855,P＜0.0001);与血清病毒载量也呈正相关(r=0.48316,P=0.0006);与血清转氨酶、肝组织炎症活动度、纤维化分期无明显相关性.以PBMC病毒载量作为因变量,进行逐步回归分析.得到逐步回归方程:Y=3.71301+0.16946X(Y:PBMC病毒载量;X:肝组织病毒载量).结论:PBMC中病毒载量受肝组织病毒量的显著影响,一定程度上提示PBMC中可能存在复制型的HBV.
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miR-221在胰管内乳头状黏液性肿瘤患者血浆中的表达及其意义
已有研究证实微小RNA( miRNA)在人类肿瘤中表达异常,其中miR-221在结直肠癌中表达显著增高,可能作为肿瘤标志物[1].我们采用定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测胰管内乳头黏液性肿瘤(IPMN)和胰腺导管腺癌患者血浆中miR-221的表达,探讨其作为IPMN诊断标志物的可能性.
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血浆miR-9在小鼠急性胰腺炎向慢性胰腺炎转化过程中的表达及意义
寻找检测方便、特异性高的标志物对早期诊断慢性胰腺炎至关重要.微小RNA(miRNA)是18 ～24个核苷酸长度的小分子非编码RNA,通过与特定的3’非编码区序列结合调节靶mRMAs的稳定性和翻译效率,与人类正常生理过程和疾病密切相关[1].有研究显示某些miRNA可能参与胰腺炎腺泡细胞凋亡过程的凋节[2].因为临床上难以观察到急性胰腺炎向慢性胰腺炎转化的动态过程,故我们建立蛙皮素诱导的小鼠急性胰腺炎-慢性胰腺炎模型,采用定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测此过程中血浆miR-9的表达变化.
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骨缺损修复过程中相关生长因子的基因表达
目的:通过活血中药(骨碎补、续断、自然铜、土鳖虫)对普通家兔骨缺损模型的喂养,探讨PDGF和IGF-I基因对骨缺损修复的影响.方法:健康家兔36只,其中24只按3天、1、2、4、6、8周分为6组,每组4只中再分实验组和对照组,每组2只;另外12只健康家兔为松质骨提供组,实验组和对照组普通家兔均按常规手术要求对右侧桡骨中段制成15mm的骨缺损,松质骨提供组普通家兔处死后取髂骨制成颗粒状骨植入上述骨缺损处,实验组用活血中药配置复合饲料喂养,对照组用普通饲料喂养,于术后3天、1、2、4、6、8周处死取骨缺损处移植骨痂标本做PDGF和IGF-I基因的动态定量PCR.结果:对PDGF和 IGF-I的目的基因,校正结果后,以正常骨组织拷贝数为基础,其他各组与其比值:对照组3天、1、2、4、6、8周PDGF基因分别为1.00、1.70;2.54;1.72;3.63;0.97;实验组为1.01、1.95、5.98、11.79、14.96、3.75.IGF-I对照组基因分别是1.00、3.03;4.96;1.14;2.67;0.60;0.12;实验组为0.12、2.04、4、43、10.00、19.83、3.39..结论:活血中药(骨碎补、续断、自然铜、土鳖虫)能够明显增加PDGF和IGF-I的分泌量,并提高骨组织修复质量和对成骨有显著的影响.
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定量PCR检测血清HBV-DNA与血清HBV标志物关系的研究
探讨定量PCR检测血清HBV-DNA与血清HBV标志物之间的关系及其临床意义.方法:352例血清标本运用荧光定量PCR检测血清HBV-DNA及放射免疫法(ELISA)检测血清HBV标志物.结果:经荧光定量PCR检测94例HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性的标本,其血清HBV-DNA全部阳性,DNA测值范围4.8×105～2.8×108copy/ml;81例HBsAg、HBeAb、HBcAb均阳性的标本,其血清HBV-DNA43例阳性(阳性率为53%),DNA测值范围1.0×104～1.4×107copy/ml;39例HBsAg、HBcAb阳性的标本,其血清HBV-DNA24例阳性(阳性率为61%),DNA测值范围3.5×103～1.6×107copy/ml;100例HBVM全阴性的标本,血清HBV-DNA全部阴性.结论:荧光定量PCR检测血清HBV-DNA准确灵敏,可反映乙肝患者病程变化,对于乙肝临床诊断、治疗方案的选择、疗效观察及预后判断有极其重要的作用.
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乙型肝炎病毒感染者不同血清学标志物模式与HBV-DNA定量关系的研究
目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染者不同血清学标志物模式与H BV DNA定量的关系,为乙型肝炎的诊断、治疗及预防提供诊据.方法对81 4例血清标本采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标志物,应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测HBV DNA含量.结果 HBsAg(+)、HBeAg(+)、HB c Ab(+)模式HBV DNA阳性率为87.28%(302/346),HBV拷贝数≥108/ml占63.87%;在HBsAg 阳性、HBcAb阳性模式中,有40例(48.78%),检测出HBV-DNA,部分血清标本的HBV-DNA拷贝数较 高,此可能是HBV前核心区基因突变,导致HBeAg不能表达,但病毒本身复制未受影响HBeAg( + )模式的HBV DNA阳性率、拷贝数明显高于其它不同血清学标志物模式(P＜0.005).[ HTH 结论单凭血清学标志物模式难以准确判断HBV的复制程度及传染性的强弱, 定量检测HBV DNA能 真实反映HBV复制情况,对乙型肝炎的诊断及防治提供客观依据.
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慢性肝病患者血清HBV-DNA定量检测及临床应用
目的探讨乙肝病毒(HBV)DNA含量与慢性肝病临床病程和乙肝标志物的关系及其在治疗疗效观察中的应用价值。方法采用TagMan荧光标记探针技术检测113例各型慢性肝病患者血清HBV-DNA含量。结果以慢性乙肝轻型HBV-DNA含量高，随肝损害加重，HBV-DNA含量逐渐下降。血清HBV-DNA含量在HBeAg阳性组明显高于HBeAg阴性组，而与ALT、AST及肝硬化不同Child分级无相关性。治疗前HBV-DNA含量低者疗效好，且不同疗效HBV-DNA含量变化不同。结论定量PCR检测血清HBV-DNA含量对了解慢性乙肝患者病毒复制情况和临床病程的关系及治疗评价有一定价值。
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γ射线对人淋巴细胞Tobl基因转录表达的影响
目的 研究γ射线对人周围血淋巴细胞Tobl基因转录表达的影响.方法 对数生长期的淋巴细胞,分别给予1、2、3 、4、 5、6 Gy的60 Coγ射线照射,照射后12、24 h,以及2 Gy照射后4、8、12、24、36、48、72 h分别提取总RNA,反转录成cDNA.利用实时荧光定量聚合酶链反应技术,检测各组Tobl基因表达改变.结果 2 Gy照射后4、24、36 h,Tobl mRNA表达水平升高,均是对照组(未照射组)的1.99倍以上(P<0.05).1～5 Gy范围内照射后24 h,Tobl mRNA表达水平随着剂量的增加而增加差异有统计学意义(P<0.05).在1-5 Gy范围内照射后12 h,Tobl mRNA表达水平和对照组比较差异无显著性(P>0.05);6 Gy时其表达水平达高,为对照组的16.37倍(P<0.05).结论 γ射线照射后人淋巴细胞Tobl基因的表达,在一定剂量范围内的特定时间内呈剂量依赖性上调,Tobl可能会发展为核事故受照射人员的分子生物学剂量标记物.
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定量聚合酶链反应在干扰素治疗慢性乙型肝炎中的应用研究
本研究试通过定量聚合酶链反应检测HBV DNA含量,探讨其与干扰素(IFN)疗效间的关系,为临床合理用药提供依据.
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定量PCR检测慢性肝病患者血清HBV DNA含量及其临床意义
目的:探讨慢性肝病患者血清HBV DNA含量与乙肝标志物(HBVM)和肝损害程度的关系.方法:分别用定量聚合酶链反应(PCR)法和酶标法(ELISA)检测207例乙型肝炎病毒慢性感染者血清HBV DNA含量与乙肝病毒血清标记物(HBVM).结果:HBsAg(+),HBeAg(+),抗-HBc(+)患者血清HBV DNA含量(107.407 0±2.383 0拷贝/ml)显著高于HBsAg(+),抗-HBe(+),抗-HBc(+)患者的含量(105.1251±3.4797拷贝/ml)(P＜0.001);不同临床类型HBV感染者HBV DNA含量:慢性肝炎轻、中、重度,肝炎后肝硬化,慢性重症肝炎5组间无显著性差异(P＞0.05).结论:HBV DNA含量与HBeAg密切相关;HBVDNA复制水平与慢性肝病的病期无明显关系.
关键词： 乙型肝炎病毒核酸 乙肝病毒血清标志物模式 定量聚合酶链反应 -
定量聚合酶链反应的临床应用近况
聚合酶链反应(PCR)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等的诊断.但该技术大多为定性分析,结果重复性差,可靠性低,因而给临床诊断带来混乱.近年来,随着分子生物技术的发展,在常规PCR技术基础上发展起来一种新的技术,即定量PCR[1,2].定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术的DNA高级扩增,探针技术特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点,克服了常规PCR定性检测的一些不足,极大地提高了检测的敏感性和特异性[3].现将定量PCR的临床应用近况作一综述.
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乙肝血清标志物与HBV-DNA定量测定的关系探讨
目的:研究乙型肝炎病毒标志物检测结果与HBV-DNA定量检测的关系及临床意义.方法:采用Amplisensor定量PCR系统测定HBV-DNA含量,并用ELISA方法测定HBV标志物HBsAg、HBeAg.结果:108例血清标本中,HBsAg(+) HBeAg(+)组的HBV-DNA平均拷贝数为107.52±1.65;HBsAg(+) HBeAg(-)组的HBV-DNA平均拷贝数为104.61±1.14;HBsAg(-) HBeAg(-)组的HBV-DNA平均拷贝数为103.07±1.02;正常对照组平均拷贝数为103.22±1.38.HBsAg(+) HBeAg(+)组的HBV-DNA平均拷贝数显著高于其它各组.结论:HBV标志物检测结果与HBV-DNA定量结果相互印证,ELISA法是一项灵敏度高、成本低、适用范围广的检测方法.
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1,25-二羟维生素D3对脊柱结核患者外周血单个核细胞的NO及iNOS的影响研究
目的:研究1,25-二羟维生素D3(DHVD3)作用下脊柱结核患者外周血单个核细胞(PBMC)中一氧化氮(NO)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)含量变化,探讨其对脊柱结核患者的免疫调节作用.方法:患者PBMC分为试验组(加入DHVD3)和对照组(加入培养基),接种卡介苗后培养;采用硝酸还原酶法测定不同时间点(0、3、6、9、12 d)试验组和对照组培养上清液中NO的相对吸光度值,分析其变化规律;于第6天收获2组培养细胞,提取细胞总RNA,逆转录后,定量聚合酶链反应(PCR)扩增,对目的基因iNOS及参照基因3-磷酸甘油醛脱氢酶的mRNA进行分析,用相对定量方法2-△△ct比较其差异.结果:细胞培养第6天,试验组NO的相对吸光度值和iNOS的mRNA含量均高于对照组(P<0.05).结论:DHVD3可使脊柱结核患者PBMC内iNOS的含量增加,进而促进NO的分泌,从而增强单个核细胞对结核杆菌的吞噬作用.
