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1例尿路感染患者尿液检出Candida nivariensis
传统的真菌鉴定方法主要根据真菌的形态学、生理生化特点、抗原构造等特征,但由于真菌种类众多、个体多态性明显,传统的鉴定方法常会得出假阳性或假阴性结果.尤其新发病原菌,很难从表型特征来鉴定.本实验通过形态学、生化反应、内转录间隔区(ITS)基因序列测定结合系统发育分析方法从1例尿路感染患者尿液中鉴定分离出Candida nivariensis,为国内首次报道该菌引起尿路感染病例.
关键词： rDNA 尿液 Candida nivariensis 内转录间隔区 鉴定 -
rDNA-ITS序列分析鉴定皮肤癣菌的应用评价
目的:探讨对核糖体RNA(ribosomal RNA,rDNA)内转录间隔区(internal transcribed space,ITS)的基因扩增测序技术在皮肤癣菌鉴定中的应用价值.方法:从39株临床收集的皮肤癣菌临床标本和经培养后的标本中分别提取DNA,应用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增和基因测序,测序结果在NCBI的基因库中查询,通过BLAST工具比对分析进行rDNA-ITS序列分析分子鉴定.同时根据形态特征、生长特性以及生理生化指标对经培养后的标本进行表型鉴定,并与分子鉴定结果相比较.结果:两组标本均成功扩增到ITS靶基因,经测序分析,临床标本和经培养后标本rDNA-ITS序列分析结果一致,与表型鉴定结果相吻合.结论:直接从临床标本中提取致病菌DNA并进行ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定皮肤癣菌.
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骨髓增生异常综合征患者播散性阿萨希毛孢子菌感染1例
患者男，28岁。2014年6月23日因“血三系低下6年，反复发热4月余”就诊，拟“骨髓增生异常综合征”收入我院。体检：体温39.9℃，脉搏140次/min ，呼吸20次/min，血压109/65mmHg；血白细胞0.2×109/L，中性粒细胞百分数11.4%，淋巴细胞百分数86.9%，血红蛋白66g/L，血小板12×109/L，C反应蛋白81.70mg/L，血糖7.24mmol/L，尿蛋白（++）。神志欠清，精神软，重度贫血貌。全身皮肤广泛瘀斑，右眼角膜色白，双侧颈部、腋下、腹股沟淋巴结未触及肿大。胸骨区明显压痛。双肺听诊呼吸音急促，双下肺可闻及弥漫性湿啰音。心率140次/min，律齐。腹部平软，无明显压痛及反跳痛，肝、脾肋下未及。2014年8月5日患者血液无菌采集后放入 Bact/Alert 3D血培养仪培养，需氧瓶60h报警，直接涂片见真菌孢子，转种血平板、沙保弱培养基，观察菌落形态；同时采用Vitek-2 Compact 自动微生物分析仪的YST卡对该菌进行鉴定，使用 Bruker质谱仪对纯培养物进行质谱分析；提取该菌DNA采用 PCR技术扩增核糖体内转录间隔区（IST）区确定菌种，PCR反应的特异性引物参照 Rodriguez 等[1]文献设计，引物序列为：5′-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG。结果发现，血平板上呈白色干燥的菌落（见图1）；沙保弱培养基上培养24h后呈白色、粉尘状菌落，培养48h后菌落圆形、干燥、中心隆起，有细皱褶的酵母样菌落，以后菌落逐渐变灰，干燥，呈膜样，上有细绒毛（见图2）；挑取菌落镜检，镜下见菌丝、关节孢子和多种形状的小分生孢子，细胞质内可见多量具有折光性的小泡。菌丝分支分隔，粗细不等，1~3滋m。关节孢子数目不等，长短不一，每一关节孢子多呈矩形，（2.4~4.8）滋m×（4.8~9.6）滋m，两端圆滑。小分生孢子多呈卵形（2.4~6.0）滋m×（2.9~9.6）滋m，出芽或不出芽，可见预生、间生或游离圆形厚壁孢子，直径3~6滋m（见图3、4）。Vitek-2 YST卡鉴定和Bruker质谱仪分析结果均为阿萨希毛孢子菌。经PCR扩增，琼脂糖电泳检测，可得540bp的IST区目的片段（见图5），测序后再经Blast比对分析，其与阿萨希毛孢子菌（序列号 gb|JX174411.1|）的符合率为99%，确定该菌为阿萨希毛孢子菌。根据以上结果，诊断为阿萨希毛孢子菌血症--播散性阿萨希毛孢子病。立即静脉滴注伊曲康唑0.4mg/d ，后根据体外药敏结果改用伏立康唑0.4mg/d 和两性霉素 B联合治疗，后者首日1mg ，以后每日增量5~60mg。终患者出现多种并发症及多器官衰竭，播散性阿萨希毛孢子菌病抗真菌治疗效果不佳放弃治疗出院。
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rRNA基因内转录间隔区作为遗传标记的应用现状及前景
随着分子生物学技术的不断发展,rRNA基因内转录间隔区(ITS)作为一种遗传标记,已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定、中药材鉴定和品质评价、植物种质资源鉴定、动物种系发生、遗传多样性与亲缘关系、病原诊断、系统发育研究等不同方面的研究.文章就近年来rRNA基因内转录间隔区的应用现状及前景进行综述.
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耶氏肺孢子虫分型的遗传标志研究进展
耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jirovecii,P.jirovecii)是一种呈世界性分布、可以感染人体的机会性致病性真菌(以前又名卡氏肺孢子虫),所导致的肺孢子虫肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是艾滋病等免疫机能低下患者常见、反复发作的并发症和主要致死原因.近年来,国外许多学者对P.jirovecii进行了大量的种内分型研究,分型遗传标志主要包括核rRNA的内转录间隔区(ITS)[1～12]、线粒体核糖体大亚基RNA(mtLSUrRNA)基因位点[2,13～20]、二氢叶酸合成酶(DHPS)基因位点[2,21～26]和主要表面糖蛋白(MSG)表达位点.本文就以上遗传标志的研究进展进行综述.
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应用rDNA ITS测序检测海南岛条件致病性真菌
目的:应用内转录间隔区(ITS)引物建立一种较为敏感、特异检测和鉴定条件致病性真菌的方法,为进一步鉴定不同真菌的种、型的亲缘关系提供分子生物学依据.方法:用常规的真菌检验方法对76 份口腔标本做初步鉴定,采用通用引物ITS1、ITS4对可疑真菌菌悬液进行PCR扩增,PCR扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对分析.结果:ITS-PCR扩增出种特异的DNA条带,检测菌株76株,DNA测序鉴定出白假丝酵母菌53株(69.7%),其他真菌23株(30.3%).结论:采用ITS引物测序法,可准确地检测出不同种的条件致病性真菌,并为进一步鉴定菌株的变异性,发现亚种提供基础.
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四川地区念珠菌性外阴阴道炎快速鉴定和菌种构成研究
目的 建立快速诊断、鉴定外阴阴道念珠菌病病原体的方法,并分析四川地区外阴阴道念珠菌病菌种构成情况.方法 直接从阴道炎患者宫颈分泌物中提取真菌DNA,扩增ITS1-2区,与培养法比较检出阳性率.分析念珠菌性阴道炎患者致病菌种构成特点;比较VVC患者与RVVC患者以及不同年龄段阴道炎患者菌种分布特点.结果 对阴道分泌物的快速分子检测无论敏感性还是时效性都明显优于传统培养法;白念珠菌是引起念珠菌性阴道炎的优势致病菌.非白念珠菌在RVVC患者以及40岁以上患者感染比例增高.结论 用分子生物学方法快速鉴定外阴阴道念珠菌病的病原菌有利于正确、及时地制订治疗方案.
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一株冬虫夏草内生真菌的鉴定
从野生冬虫夏草中分离、筛选出一株内生真菌JY6-6,观察菌株JY6-6在PDA培养基上培养的形态特征以及菌丝体、分生孢子结构等的显微特征,结果发现该菌株与蝙蝠蛾拟青霉的形态特征基本一致;应用内转录间隔区(ITS)序列测序分析,该菌株与GenBank中公布的多株蝙蝠蛾拟青霉序列的相似性均高达99％以上;对相关菌株的ITS基因片段的组分进行分析结合形态特征,终将其鉴定为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyceshepiali KF770692.为进一步研究和开发冬虫夏草替代品奠定了基础.
关键词： 冬虫夏草 形态特征 内转录间隔区 蝙蝠蛾拟青霉KF770692 -
应用rDNA ITS区测序评估API20C AUX及CHROMagar对酵母菌的鉴定
目的 使用真菌内转录间隔区(ITS )测序分析鉴定酵母菌的方法评估API 20C AUX和CHROMagar两种鉴定方法,为临床实验室选择快速、准确鉴定酵母菌的方法提供依据.方法 收集同济医院2010～2012年临床分离的172株酵母菌,以ITS区测序分析鉴定方法为标准,对API 20C AUX及CHROMagar 24 h,48 h显色鉴定方法进行评估,计算其鉴定符合率.结果 与测序分析比较,API20C AUX鉴定对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌的鉴定符合率均为100%,对新型隐球菌及近平滑念珠菌的鉴定符合率分别为95%和97.6%;CHROMagar对白色念珠菌和克柔念珠菌24 h和48 h鉴定符合率均为100%,对热带念珠菌24 h和48 h鉴定符合率分别为85.3%和94.1%,对光滑念珠菌24 h和48 h鉴定符合率分别为70%和83.3%,对新型隐球菌和近平滑念珠菌不能进行鉴定.结论 API 20C AUX鉴定系统可以作为临床实验室常规鉴定的手段,对于CHROMagar鉴定培养基只能用于实验室对酵母菌的初步筛查,对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌的鉴定效果较好,对其他念珠菌及隐球菌的鉴定还需其他方法进行补充.
关键词： 酵母菌 内转录间隔区 API 20C AUX CHROMagar -
白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测及抗真菌药物敏感性分析
目的:建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应方法,快速定量检定临床标本中的白色念珠菌并进行抗真菌药物敏感性分析.方法:针对白色念珠菌内转录间隔区和26S核糖体核糖核酸基因设计特异性引物和探针,构建含有上述基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,评价其特异性、灵敏度、重复性和稳定性.对1 185份临床标本中的白色念珠菌进行检测,同时进行真菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定.对所有真菌分离株进行抗真菌药物敏感性试验.结果:研究结果显示,建立的白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法专属性强,能准确检出白色念珠菌,而与其他念珠菌属真菌、非念珠菌属真菌、细菌、寄生虫和病毒均无交叉反应,特异性为100％.该技术灵敏度高,能精确定量检测白色念珠菌DNA线性范围达11个数量级,白色念珠菌低检测限度为5个菌落形成单位.该方法重复性非常好,组内和组间相对标准偏差均小于2％.测试中相关系数、斜率和效率没有显著变化,表明该方法稳定性好,精密度高.将其成功应用于临床标本中白色念珠菌载量的定量检测,用普通PCR和基因克隆测序分析进行了确证.整个检测过程可在2h内完成,可以用作定量分析快速诊断方法.应用TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应从1185份临床标本中检出94份白色念珠菌阳性标本,真菌培养获得8株存活的白色念珠菌,抗真菌药物敏感性试验分析结果显示:这些白色念珠菌分离株对制霉菌素、咪康唑、克霉唑、益康唑、氟康唑、沃尔康唑均敏感,但对两性霉素B、酮康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶已经产生了耐药性.结论:本研究新开发评价的TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应,可以快速简易,精准稳定,特异灵敏地定量检定白色念珠菌,适用于动物源性产品中白色念珠菌检测、食品药品生物制品医疗器械安全检查、环境监测、流行病学调查.
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ITS1作为DNA条形码用于冬虫夏草与其近缘种的鉴别
目的:考察内转录间隔区1(ITS1)是否可以作为有效鉴别冬虫夏草的DNA条形码.方法:提取冬虫夏草及常见伪品虫草的基因组DNA,以聚合酶链式反应(PCR)扩增并测序得到ITS序列,用CondonCode Aligner软件处理得到ITS1序列;从Gen-Bank数据库下载冬虫夏草及常见伪品虫草的ITS1序列.用MEGA软件进行变异位点、Kimura-2-parameter(K-2P)遗传距离、Neighbor-Joining(N-J)进化树分析.结果:冬虫夏草种内ITS1区存在5个多态性位点;大种内距离0.039,小于小种间距离(0.154);在系统进化树中,冬虫夏草聚为一支,可与虫草属其他种类虫草明确区分,Bootstrap值为100％.结论:ITS1可作为理想的DNA条形码用于冬虫夏草与常见虫草属伪品的鉴别.
