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基于内转录间隔区和β-微管蛋白部分基因及相关序列扩增多态性分子标记技术推断红曲霉系统发育关系
目的 基于内转录间隔区(ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)部分基因和相关序列扩增多态性(SRAP)分子标记技术结合形态学鉴定方法,推断不同种红曲霉的系统发育关系,寻找快速、准确鉴定红曲霉的方法.方法 以红曲霉基因组为模板,聚合酶链式反应(PCR)扩增红曲霉ITS、β-tubulin部分基因,利用Mega 7.0软件中大似然树法构建进化树,扩增SRAP分子标记技术的特征结合序列,利用R软件phangorn包中的FigTree软件进行建树,使用除权配对(UPGMA)法进行聚类分析,通过分析不同种红曲霉系统发育关系,找寻快速、准确的鉴定方法.结果 利用ITS和β-tubulin部分基因可将31株供试菌株分为两大类,而SRAP分子标记技术可将供试菌株分为四大类,结合袁型分析和3种分子鉴定方法,参照15株红曲霉参考菌株将16株未鉴定到种的红曲霉分别鉴定为安卡红曲霉、橙色红曲霉和紫色红曲霉.结论 SRAP分子标记技术具有更多的分类依据,结合表型分析能够帮助更快、更精确的将红曲霉鉴定到种.
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黄芩ITS2条形码数据库构建及其种子的DNA条形码鉴定方法建立
目的:通过构建黄芩核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码数据库,建立黄芩种子DNA条形码鉴定新方法,保障黄芩种子基原准确.方法:收集黄芩对照药材、基原植物、生药材、公共数据库及其常见代用品的ITS2序列,构建黄芩DNA条形码数据库;收集62份市售黄芩种子样品,每份种子获取3～4条ITS2序列,基于BLAST方法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定.结果:共获得101条黄芩及其代用品的ITS2序列.黄芩的种内序列变异小于种间序列变异,黄芩、甘肃黄芩和粘毛黄芩在NJ系统发育树上分别聚为独立的支,可相互区分.共获得195条黄芩种子的ITS2序列,DNA条形码鉴定结果表明193条为黄芩序列,2条为真菌序列.结论:黄芩ITS2条形码数据库稳定可靠,可满足黄芩种子DNA条形码鉴定的需求.DNA条形码技术可用于黄芩种子的物种鉴定.
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柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定
目的:建立柴胡及其伪品DNA指纹鉴别方法.方法:采用改良的CTAB法提取柴胡及常见伪品的干根基因组DNA,设计鉴别正品柴胡及其伪品的特异性引物,利用PCR扩增技术对正品柴胡及其伪品进行DNA指纹鉴定.结果:改良的CTAB法提取出大小为23 kb的基因组DNA条带,纯度在(1.71±0.11),且经特异引物PCR扩增,只有正品柴胡能扩增出173bp大小的片段,而伪品未能扩增出目的片段.结论:柴胡DNA具有特异性指纹特征,可作为市售柴胡的真伪鉴定依据.
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鹰爪花茎和叶中内生真菌的组织化学定位与分子鉴定
目的:研究鹰爪花Artabotrys hexapetalus茎叶的显微结构及其内生真菌在组织内的分布特点及种类鉴定.方法:采用石蜡永久制片法对鹰爪花的显微结构进行研究,细胞化学法确定内生真菌的分布,平板分离法对内生真菌分离培养,通过rDNA中内转录间隔区(ITS)序列进行分类鉴定.结果:鹰爪花茎次生构造由周皮、皮层和维管柱组成,韧皮部纤维成层分布；叶为异面叶,主脉维管束为外韧型,具纤维组成的维管束鞘；茎和叶多个组织有内生菌分布.共分离鉴定18株内生真菌,其中拟茎点霉Phomopsis spp.是鹰爪花内生真菌优势菌群,占分离总数的61.1％,其次为胶孢刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides.结论:鹰爪花茎和叶显微特征明显,其内生真菌的分布无明显组织特异性,拟茎点霉为鹰爪花内生真菌的优势种群.
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中国耶氏肺孢子虫基因型的初步分析
为研究我国耶氏肺孢子虫的基因分型,利用巢式PCR方法扩增24例肺孢子虫肺炎(PCP)患者支气管肺泡灌洗液中的耶氏肺孢子虫(Pneumocystis jiroveci)核糖体DNA内转录间隔区(ITS1-5.8S rDNA-ITS2)基因.纯化回收目的片段,将其克隆到PMD18-T载体,并导入JM109细胞系中,每个标本制备3～5个克隆,提取质粒测序.从19例患者的标本中检出ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因,其中12份标本的25个克隆的测序结果可用于基因分型.经与Lee等(1998)的分型标准进行比对,本组病例耶氏肺孢子虫的ITS1分为B、E、I、N 4型,常见的为E型;ITS2分为a、b、e、h、i、n 6型,常见的为i型;ITS基因分9型,以Bi多见,有2份标本存在混合感染.
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胃肠疾病患者口腔与胃黏膜念珠菌基因型相关性分析
目的 探讨胃肠疾病患者口腔与胃黏膜寄居念珠菌菌株基因型的相关性. 方法 对154例因消化不良就诊的患者分别采集口腔及胃黏膜标本、分别用念珠菌显色培养基分离鉴定念珠菌,进行内转录间隔区(internal transcribed spacer region,ITS)基因测序并申请GenBank登录序列号,观察同一患者口腔和胃黏膜念珠菌菌种是否一致.在菌种一致患者中,随机抽取其口腔和胃黏膜分离菌株进行多位点序列分型(multilocus sequencing typing,MLST),并分析口腔及胃黏膜念珠菌基因型进化情况. 结果 46例(占29.87％)患者口腔与胃黏膜同时检出念珠菌,其中,37例(占80.43％)患者口、胃分离株均为白色念珠菌:包括胃炎患者25例,溃疡患者11例,胃癌患者1例.随机选取来自24例患者的48个分离株进行白色念珠菌MLST分型,结果显示,20例(占83.33％)患者的双标本基因型一致. 结论 胃肠疾病患者口腔与胃黏膜念珠菌菌种和基因型一致率较高,且消化性溃疡患者感染率高于胃炎患者.
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吉林省延边地区图们江流域按蚊形态学及基因特征分析
目的 了解吉林省延边朝鲜族自治州(延边州)图们江流域按蚊种类,掌握常见按蚊形态特征和基因特征.方法 于2012-2013年5-10月选择吉林省延边州图们市月晴镇、曲水镇和龙井市开山屯镇3个边境村,利用诱蚊灯法采集当地按蚊雌成虫,提取其基因组DNA,利用其核糖体核酸内转录间隔2区段(rDNA ITS2)基因特征,应用PCR基因鉴别技术,确定其种类.对按蚊基因组DNA扩增产物进行测序,与GenBank中按蚊序列进行同源性分析,进一步确定延边地区图们江流域按蚊基因特征.根据分子生物学鉴定结果,反向分析其形态特征.结果 在延边州图们江流域共发现赫坎按蚊种团(Anopheles hycranus group)类中华按蚊、克莱按蚊、雷氏按蚊、暗灰按蚊(近黑按蚊)和比伦按蚊,其蚊种基因组DNA扩增序列与GenBank中已发表相应按蚊序列的同源性达97％～100％.克莱按蚊、暗灰(近黑)按蚊和雷氏按蚊的亚缘脉白斑、亚尖端白斑、尖端白斑和翅5.2纵脉末端繸斑(fringe)在形态学上存在明显种特异性.结论 在延边州图们江流域未发现中华按蚊和朝鲜按蚊.比伦按蚊为该地首次发现,与已发现的克莱按蚊同为该地首次纪录种.将原纪录种嗜人按蚊订正为雷氏按蚊,原八代按蚊订正为暗灰按蚊.利用按蚊雌成虫翅白斑种特异性可对克莱按蚊、暗灰(近黑)按蚊和雷氏按蚊等新蚊种和近缘种快速、便捷地进行形态学鉴定.
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16S～23S rDNA内转录间隔区序列分析及其在分支杆菌鉴定中的应用价值
目的研究16S～23S rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列在分支杆菌鉴定中的应用价值.方法应用PCR-直接测序法对22种30株分支杆菌参考菌株和16株分支杆菌临床分离菌株16S～23SrDNA ITS 测序.对所测定序列以及GenBank所报道的有关序列用Clustal程序(MegAlign Package [Windows Version 4.01];DNASTAR,Madson,Wis)处理分析,计算种间相似性,用PHYLIP Package构建分支杆菌菌种聚类分析树状谱.结果除结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)16S～23S rDNA ITS序列完全一致外,其它分支杆菌菌种间核苷酸排列顺序及长度变异较大,种间相似性为30.4%～86.5%,聚类分析树状谱能将各分支杆菌菌种相分离.结果表明16S～23S rDNA ITS序列分析能将MTC与非结核分支杆菌(NTM)相鉴别,能将NTM鉴定至种的水平.结论 16S～23S rDNA ITS可做为分支杆菌鉴定的靶基因.
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临床少见丝状真菌的实验室诊断
目的：通过对临床少见丝状真菌的分离和分析鉴定，探讨尖端赛多孢子菌、裂褶菌、短柄帚霉、匍枝根霉、茄病镰刀菌等临床不常见丝状真菌的实验诊断方法，为临床明确诊断真菌感染种类提供科学依据。方法从临床标本培养出的5株真菌用形态学方法未能作出准确鉴定，通过聚合酶链反应（PCR）和基因测序方法分析核糖体转录间隔区域 ITS 和 ITS2序列，在 NCBI 网站应用 Blastn 对获得的基因序列进行同源性分析及利用 GenBank 中的系统发育软件自动生成系统发育树，以确定丝状真菌的种。结果rDNA-ITS 序列分析结合形态学分析，5株菌均可鉴定到种的水平，鉴定结果分别是：尖端赛多孢子菌、裂褶菌、短柄帚霉、匍枝根霉和茄病镰刀菌。结论传统形态学方法，极易受检验人员经验水平影响，对于罕见菌株甚至不能作出鉴定，利用真菌的 ITS 序列的特异性，可快速、准确将大部分丝状真菌鉴定到种水平。
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基于ITS区多态性研制用于柴胡属植物来源生药鉴定的寡核苷酸DNA芯片
目的 常用生药柴胡正品为柴胡属植物柴胡及狭叶柴胡的干燥根.当前,同属多种植物也做柴胡内转录间隔区使用.仅凭生药性状及显微特征难以进行真伪鉴别.在本实验中,笔者针对6种不同柴胡属植物来源的柴胡生药,基于其内转录间隔区(ITSI)区多态性研制了用于其鉴别的DNA芯片.方法 将设计的特异性寡核苷酸探针点印于基质上制备芯片;从待检测样品中提取基因组DNA,扩增ITS1片段,并以荧光标记后,与芯片杂交.结果 在与其相应的探针位置即可出现信号;每种不同来源的柴胡有其特异的杂交谱图.结论 研制的DNA芯片可为柴胡类生药的鉴定提供可靠便利的途径.
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中药葛根及其近缘种的rDNA-ITS序列分析
目的探讨中药葛根及其近缘种的分类地位及系统发育关系,同时为葛根的指纹图谱鉴别提供分子标记.方法测定并分析葛属3种植物的内转录间隔区(ITS)序列及5.8S rRNA基因序列.结果测得该属3种植物的片段包括ITS1,5.8S和ITS2全长序列以及18S,26S部分序列.野葛与粉葛的ITS1,ITS2的差异性分别在2.10%和2.09%以内,而山葛与野葛、粉葛在ITS1,ITS2的差异性则分别达到8.14%和12.82%以上.根据ITS序列特征构建的系统树,不同产地的野葛首先聚类,然后与粉葛聚在一起,山葛后聚类.结论根据分子性状特征,粉葛作为野葛的变种,山葛独立成种较为合理.ITS序列特征是中药葛根鉴别的有效分子标记.
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rRNA基因内转录间隔区测序分析在中草药鉴定中的应用
目的:研究rRNA基因内转录间隔区(internaltranscribded spacer,ITS)PCR扩增及碱基测序分析对中草药进行鉴定的方法,并探讨该方法的科学性及其应用价值.方法:应用PCR-碱基测序法对所提取的植物性中药材DNA中的rRNA基因内转录间隔区进行PCR扩增和序列测定,以获得不同植物性中药材rRNA基因内转录间隔区扩增产物电泳图谱和碱基序列,以此作为中药材的分子鉴定标记.结果:不同中草药rRNA基因内转录间隔区电泳条带,碱基序列组成,长度各不相同.结论:不同植物性中药材rRNA基因内转录间隔区可作为分子生物学水平鉴定中草药的靶基因之一.
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沈阳和抚顺地区上消化道疾病患者胃黏膜念珠菌感染状况
目的 调查分析沈阳和抚顺地区上消化道疾病患者胃黏膜念珠菌感染状况.方法 胃镜下钳取沈阳和抚顺地区214例上消化道疾病患者胃黏膜,快速尿素酶法检测幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori);采用CHROMagar培养基显色培养念珠菌,对分离到的各病患组念珠菌菌株进行内转录间隔区(internal transcribed spacer region,ITS)测序并申请GenBank登录序列号,与正常人群组口腔黏膜的念珠菌菌株共同建立进化树,观察进化情况,比对分析序列同源性.结果 胃黏膜寄居念珠菌阳性率为40.65％(87/214),各组间念珠菌阳性率比较差异有统计学意义(x2=8.785,P＜0.05).消化性溃疡患者H.pylori与念珠菌同时感染的阳性率(44.44％,24/54)高于慢性胃炎患者(13.46％,29/156).ITS测序鉴定出6种念珠菌,分别为白色念珠菌71株(80.46％),光滑念珠菌8株(9.20％),热带念珠菌1株(1.15％),克柔念珠菌1株(1.15％),C.caribbica 1株(1.15％),葡萄牙念珠菌7株(8.05％).慢性胃炎组、溃疡组、正常人群组白色念珠菌菌株的进化树分支方向明显不同.结论 沈阳及周边地区上消化道疾病患者胃黏膜感染的念珠菌中白色念珠菌为优势菌种;念珠菌与H.pylori同时感染者有胃黏膜损伤程度加重现象.
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一株祁连山野生毛头鬼伞菌的分离鉴定及其生物学特性分析
目的 对一株祁连山大型野生食用菌进行分离鉴定,并分析其生物学特性.方法 经组织分离获得野生菌株QL-8,提取其基因组DNA,以其为模板扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段,并进行测序及系统发育分析.采用单因素试验方法检测温度(18、20、22、24、26、28℃)、pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、碳源(蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、葡萄糖)、氮源(硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、尿素)、无机盐(硫酸铁、硫酸钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、硫酸镁)、维生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12、VB复合)对菌丝生长的影响.使用不同栽培料(棉籽壳、木屑、粪草)对野生菌进行栽培试验.结果 菌株QL-8属于毛头鬼伞属,GenBank登录号为KF702392.菌丝生长的适温度为24～ 26℃,适pH为7.0,适碳、氮源分别为蔗糖和酵母粉,添加一定量的硫酸镁和VB6有助于菌丝的生长.该菌株于木屑培养料中生长快,满袋后覆土即可出菇.结论 成功获得了菌株QL-8的生长特性和出菇条件,并培育出野生毛头鬼伞子实体,为天然野生菌实现人工栽培提供了实验依据.
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rDNA-ITS序列分析对临床少见丝状真菌鉴定作用的评估
目的 评价内转录间隔区(ITS)的多态性序列分析(rDNA-ITS序列分析)对临床少见丝状真菌的鉴定作用,以形态学鉴定方法加以补充验证.方法 将3株待检真菌通过聚合酶链反应(PCR)扩增和基因测序方法分析rDNA-ITS序列,从GenBank获取相似序列,使用BLAST工具对rDNA-ITS序列进行对比分析,利用GenBank 中的系统发育软件自动生成系统,构建系统发育树,根据系统发育树并结合对比指标确定距离与同源性均有较大鉴定意义的对比序列,并与真菌ITS1、ITS2、26S rDNA D1/D2片段的序列分析结果及形态学鉴定结果进行比较.结果 2株菌株能通过rDNA-ITS序列分析的方法鉴定到种,另1株由于相似序列较多,需要形态学方法加以配合鉴定.rDNA -ITS序列分析相对真菌ITS1、ITS2、26S rDNA D1/D2片段有更好的真菌鉴定作用.结论 相对于传统形态学方法,利用rDNA-ITS序列分析鉴定丝状真菌不受检验人员经验水平影响,较为客观,同时由于其包含的信息量相对丰富,因此,较其他靶序列具有更好的真菌鉴定作用.但该方法也存在一定局限,因此,仍需结合形态学方法进行鉴定.
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华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA内转录间隔区序列分析
目的 通过PCR方法扩增华支睾吸虫病患者粪便虫卵核糖体DNA (ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行分析,探讨其用于华支睾吸虫感染检测的价值. 方法 提取2例华支睾吸虫患者粪便中的虫卵DNA作模板,以rDNA ITS基因片段为目的片段进行PCR扩增,对扩增片段进行测序分析. 结果 从2例患者粪便虫卵样本中均扩增出1 123 bp的条带,经序列比对确定患者粪便中的虫卵为华支睾吸虫卵.测序分析发现本研究的两个样本与中国黑龙江分离株(KF740425)相似性为100％. 结论 本研究从2例华支睾吸虫病患者粪便虫卵中成功扩增出rDNA ITS基因,为从分子生物学角度检测华支睾吸虫病提供了资料.
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山丘疫区杜氏利什曼原虫核糖体基因内转录间隔区的克隆及序列分析
目的构建我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株前鞭体核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)片段克隆,并进行测序及同源性分析.方法提取杜氏利什曼原虫前鞭毛体DNA进行PCR扩增,将扩增出rDNA ITS片段克隆人pMD18-T vector上,双脱氧链末端终止法测序.结果扩增出约1 000 bp的rDNA ITS片段.测序结果表明山丘疫区的2株利什曼原虫L.d.SC10和L.d.6分别为1 027 bp和1 028 bp.序列分析结果表明,L.d.SC10和L.d.6有一定差异.结论获得了我国山丘疫区杜氏利什曼原虫分离株L.d.SC10和L.d.6的前鞭体rDNA ITS序列.
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焦磷酸测序技术快速检测鉴定临床尿液标本中真菌方法学的建立与应用
目的 建立一种快速检测鉴定临床尿液标本中常见真菌的方法学体系.方法 收集临床尿液样本,提取DNA,利用PCR方法结合焦磷酸测序技术检测真菌的rDNA内转录间隔区,通过序列比对鉴定真菌种属.结果 通过PCR-焦磷酸测序与常规培养相比较,1 320例临床样本培养阳性180例,阳性率为13.6％,焦磷酸测序鉴定阳性192例,阳性率为14.5％.两种方法检测真菌阳性符合率为100.00％,阴性符合率为98.95％,总体符合率为99.09％,Kappa值为0.963,一致性较好.对13株标准菌株鉴定结果与实际结果相符.结论 研究所建立的PCR-焦磷酸测序直接检测临床尿液标本真菌的方法,具有快速、准确性高、重复性好、高度自动化、低成本、高灵敏度、高通量(可一次性检测96个样品)等优点,无需常规培养,能在3h内一次性区分临床常见真菌,可作为一种快速检测鉴定临床标本中真菌的方法.
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应用核糖体及其内转录间隔区基因同源性分析鉴定致病性真菌
近年来随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用,以及肿瘤、器官移植等免疫低下人群的不断增多,念珠菌、隐球菌等深部真菌感染的发生率呈现明显上升趋势.一些新的致病性真菌或真菌的新特性也在不断地被认识,而对致病性真菌的鉴定则是其认识的基础与关键[1].我们应用真菌核糖体保守区及其内转录第2间隔区基因(ITS2)序列同源性分析,为致病性真菌的分子鉴定提供一个客观依据.
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ITS基因测序分析对89株病原真菌鉴定的应用评价
目的 探讨内转录间隔区(ITS)基因扩增测序技术在病原真菌鉴定中应用价值.方法 应用通用引物ITS1和ITS4对收集的89株真菌(包括酵母菌标准菌株6株,室间质评菌7株,临床分离的酵母样真菌42株和丝状真菌34株)进行PCR扩增和基因测序.测序成功的ITS序列在CBS数据库(http://www.cbs.knaw.nl/Collections)进行序列比对,结合Mycobank(http://cn.mycobank.org/)分类信息以获得其菌种鉴定信息.结果 89株不同种类的真菌均成功扩增到ITS靶基因,经测序,89株真菌均获得扩增的全序列.序列比对结果显示,6株酵母菌标准株中,5株鉴定到种,1株鉴定到属;7株室间质评株中,1株酵母菌鉴定到种,6株丝状真菌中2株鉴定到种,1株鉴定到属,3株鉴定到复合群;42株临床分离的酵母样真菌中,39株鉴定到种,3株鉴定到属;34株临床分离的丝状真菌中,10株鉴定到种,18株鉴定到属,6株鉴定为复合群.结论 通用引物ITS1和ITS4广谱性强.ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定临床疑难真菌,但仍存在数据分析过程烦琐和结果解释困难的问题.
