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过表达miR-34a增加血肿瘤屏障通透性机制的研究
目的 探讨过表达miR-34a增加血肿瘤屏障通透性的机制.方法 将miR-34a模拟物转染至培养的人脑微血管内皮细胞NKIM-6,采用实时荧光定量PCR方法检测miR-34a的表达.用miR-34a模拟物转染的NKIM-6细胞和U87胶质瘤细胞建立体外血肿瘤屏障模型,跨内皮电阻测量系统检测血肿瘤屏障跨内皮阻抗值的变化；western blot和免疫荧光法检测体外血肿瘤屏障NKIM-6细胞中,紧密连接相关蛋白ZO-1和claudin-5的表达.结果 经miR-34a模拟物转染后,NKIM-6细胞中miR-34a的表达水平显著升高；血肿瘤屏障跨内皮阻抗值显著下降；体外血肿瘤屏障NKIM-6细胞中紧密连接相关蛋白ZO-1和claudin-5的表达水平分别显著降低,在细胞膜上呈不连续分布.结论 过表达miR-34a显著增加血肿瘤屏障的通透性,其机制之一可能与降低紧密连接相关蛋白相关.
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miR-34a调控HMGB1表达对人膀胱癌细胞增殖的影响
目的 探讨miR-34a对膀胱癌T24细胞增殖的影响.方法 合成miR-34a的模拟物并转染膀胱癌T24细胞,荧光显微镜下观察转染效率,实时荧光定量PCR法检测转染48 h后,T24细胞中miR-34a的表达情况,MTT法检测转染24、48和72 h后T24细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR法和western blot方法检测转染48 h后膀胱癌细胞内源性HMGB1 mRNA及蛋白的表达变化.结果 miR-34a的模拟物转染至T24细胞的效率为80％,转染miR-34a模拟物48 h后,T24细胞内miR-34a的表达显著升高(P＜0.05),T24细胞的增殖率显著低于阴性对照组(P＜0.05),且呈时间依赖性,HMGB1 mRNA及蛋白的表达水平明显低于阴性对照组(P＜0.05).结论 miR-34a抑制膀胱癌T24细胞增殖可能与靶向HMGB1基因相关.
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miR-34a通过Notch1信号通路对肺癌干细胞的抑制
背景：已有报道证实miR-34a对肺癌干细胞有一定的抑制作用，但是其作用机制目前还不清楚。
目的：探索miR-34a对肺癌干细胞的抑制作用及机制。
方法：应用免疫磁珠分选细胞技术从肺腺癌A549细胞系中分离出CD133+肺癌干细胞；脂质体转染技术构建miR-34a过表达的肺癌干细胞；双荧光素酶报告基因分析miR-34a与Notch1的靶向关系；基因敲除Notch1并检测其对肺癌干细胞的影响。
结果与结论：①经过免疫磁珠分选和流式细胞术检测得到高比率的 CD133+肺癌干细胞；②qRT-PCR检测发现 miR-34a 在 CD133+肺癌干细胞中的表达明显低于 CD133-肺癌细胞；③成功构建 miR-34a过表达的肺癌干细胞，发现 miR-34a 能够抑制肺癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡；④双荧光素酶报告基因分析证明Notch1与miR-34a具有靶向关系；⑤基因敲除Notch1显著抑制肺癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡；⑥结果提示，miR-34a可能通过抑制Notch1信号通路来抑制肺癌干细胞的生长。 -
miR-34a调节SIRT1表达抑制结肠癌干细胞增殖和侵袭
背景:miR-34a是一种起抑癌作用的miRNA,它能调节多个靶基因的表达,有可能成为治疗肿瘤的新靶点.目的:探讨miR-34a及其靶基因SIRT1对结肠癌干细胞体外增殖、凋亡、侵袭能力的影响.方法:采用无血清悬浮培养法从人结肠癌细胞株HCT116中富集肿瘤干细胞,流式细胞仪检测CD44+/CD133+细胞所占的比例进行鉴定.利用脂质体转染法将miR-34a模拟物转染结肠癌干细胞,并设miRNA无序阴性对照物和未转染组.CCK-8增殖实验、细胞凋亡实验、细胞侵袭实验检测结肠癌干细胞增殖、凋亡、侵袭情况.采用qRT-PCR和Western blot法检测miR-34a转染后细胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平.结果与结论:①无血清悬浮培养法富集的肿瘤干细胞球中含有较高比例的 CD44+/CD133+表型细胞,所占比例为(78.3±6.7)%;②miR-34a转染组的miR-34a表达量高于未转染组和miR-34a对照组(P < 0.05);③与未转染组和miR-34a对照组比较,miR-34a转染组的细胞增殖能力明显降低(P < 0.05);细胞凋亡率明显升高(P < 0.05);侵袭细胞数明显降低(P < 0.05);④miR-34a过表达后,miR-34a转染组的SIRT1 mRNA和蛋白的表达水平均明显低于未转染组和miR-34a对照组(P < 0.05);⑤结果表明,过表达miR-34a可抑制结肠癌干细胞增殖、侵袭并诱导凋亡,可能与其下调SIRT1的表达有关.
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miR-34a在复发-缓解型多发性硬化患者血清中表达情况研究
目的 检测复发-缓解型多发性硬化患者在急性复发期及缓解期外周血血清miR-34a的表达情况,探讨其作为新的血清标记物的可能性,以及其血清表达情况与疾病活动的关系.方法 选取2014年1月至2015年12月在哈尔滨医科大学附属第四医院神经内科就诊的复发-缓解型多发性硬化患者20例为观察组,患者均处于急性复发期且近期未接受任何治疗;患者均接受随访,在缓解期未用药物治疗(免疫调节药物等).同时,选取年龄、性别与观察组相匹配的20例健康人作为健康组.分别采集两组患者外周静脉血,提取血清总RNA,并对miR-34a进行RT-qPCR检测验证,对观察组急性复发期和缓解期、健康组分别进行多种microRNA的相对定量分析.结果 RT-qPCR检测结果显示,观察组急性复发期与健康组比较,血清中miR-34a的含量明显降低,对照组平均表达量约为观察组急性复发期的1.91倍,差异有统计学意义(P<0.05);miR-34a在观察组缓解期的血清表达与健康组比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 miR-34a在复发-缓解型多发性硬化患者的急性复发期中表达降低,并可能具有作为复发-缓解型多发性硬化急性复发期诊断的血清生物标志物潜质.
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miR －34 a通过靶向抗凋亡基因 Survivin抑制皮肤鳞状细胞癌增殖的研究
目的：研究miR－34a在皮肤鳞状细胞癌（ SCC）中的表达及对肿瘤细胞增殖、抗凋亡的调控作用及机制。方法采用实时定量PCR检测46例SCC病人肿瘤组织及15例正常皮肤组织中miR－34a及Survivin的表达；将miR－34a mimic转染进皮肤鳞状细胞癌A431细胞系，探讨miR－34a对SCC细胞增殖、Survivin表达的影响；评估miR－34a及Survivin表达对SCC预后的生物诊断价值。结果（1）低分化SCC患者miR－34a显著低于高分化组，而Survivin则显著高于高分化组（P均＜0．05）。与正常皮肤比较，SCC病人的miR－34a显著降低，而Sur-vivin表达则显著提高，P值分别为0．0013及＜0．0001，差异均有极显著性意义。（2）与未转染组相比，miR－34a mimic可以显著抑制A431细胞增殖（P＜0．05）；同时显著降低Survivin蛋白表达（P＜0．01）。（3）高miR－34a表达的SCC患者生存率显著高于低表达者，P＝0．020567；高Survivin表达的SCC患者生存率则显著低于高表达者， P＝0．008198。结论 miR－34a可通过对Survivin表达调控影响SCC细胞增殖，同时它也可作为一个很好的生物学诊断指标为评估SCC病人预后提供参考。
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miR-34a通过Snail诱导肺癌EMT及促进其转移的分子机制
目的:探讨miR-34a在肺癌组织中的表达情况以及miR-34a在肺癌细胞侵袭和迁移过程中的作用及其机制.方法:qPCR检测肺癌和正常肺组织中miR-34a的表达情况;使用miR-34a-mimic和miR-34a-inhibitor过表达和沉默miR-34a,qPCR检测沉默和过表达效果;Western blot检测沉默和过表达miR-34a后Snail蛋白的表达情况;荧光素酶报告基因检测miR-34a与Snail的相互作用;Transwell侵袭实验检测miR-34a的表达对肺癌细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-34a的表达对肺癌细胞迁移能力的影响;Western blot检测E-Cadherin、Vimentin和Twist蛋白的表达情况.结果:与正常肺组织相比,肺癌组织中miR-34a表达明显降低;且晚期、低分化和有淋巴结转移的肺癌组织miR-34a表达明显较早期、高分化和无淋巴结转移的肺癌组织低;miR-34a-mimic和miR-34a-inhibitor可以有效抑制和过表达miR-34a的表达;miR-34a能与Snail的3′ UTR特异性结合;miR-34a可以调控肺癌H1650细胞的侵袭迁移能力;过表达miR-34a上调E-Cadherin,同时下调Vimentin和Twist蛋白的表达,沉默miR-34a则相反.结论:miR-34a在肺癌中表达明显降低,且跟肺癌分期分级以及淋巴结转移与否密切相关,同时miR-34a可以通过上皮间质转化调节肺癌细胞侵袭和迁移能力.
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miR-34a调控PAX6的表达增强视网膜母细胞瘤的侵袭和迁移
目的:miR-34a靶向PAX6调控JAK1/STAT3信号通路影响视网膜母细胞瘤的侵袭和迁移.方法:免疫组化检测PAX6在视网膜母细胞瘤组织中的表达;PCR检测miR-34a在不同视网膜母细胞瘤细胞株和视网膜母细胞瘤组织中的表达;双荧光素酶报告基因系统检测miR-34a对PAX6转录活性的影响;Transwell侵袭实验检测miR-34a的表达对视网膜母细胞瘤细胞Rb44的侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-34a的表达对视网膜母细胞瘤细胞Rb44的迁移能力的影响;Western blot检测过表达miR-34a后JAK1/STAT3信号通路的蛋白表达水平.结果:与正常组织比较,miR-34a在视网膜母细胞瘤组织中表达明显降低,PAX6在非视网膜母细胞瘤中表达较高;Western blot检测在Rb44视网膜母细胞瘤中表达水平低;双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,miR-34a可以直接调控PAX6的转录活性;过表达miR-34a后,视网膜母细胞瘤细胞株Rb44的侵袭和转移能力明显降低;过表达miR-34a后,PAX6的表达水平下调,p-JAK1和p-STAT3蛋白表达下调.结论:miR-34a靶向PAX6的表达,通过JAK1/STAT3通路调控视网膜母细胞瘤的侵袭和迁移能力.
关键词： 视网膜母细胞瘤 miR-34a PAX6 JAK1/STAT3 -
miR-34a调控MSR1蛋白对前列腺癌细胞迁移和侵袭的影响
目的:探讨miR-34a通过MSR1对前列腺细胞迁移和侵袭的影响.方法:Western blot检测前列腺癌PC3细胞中MSR1表达情况;qPCR检测前列腺癌PC3细胞中miR-34a的表达情况,使用双荧光素酶实验检测miR-34a和MSR1之间的相关性;Transwell侵袭实验检测miR-34a和MSR1对前列腺癌细胞侵袭能力的影响;划痕愈合实验检测miR-34a和MSR1对前列腺癌细胞迁移能力的影响.结果:Western blot检测前列腺癌PC3细胞中MSR1的表达水平相对较高;qPCR检测前列腺癌PC3细胞中miR-34a的表达水平相对较低;双荧光素酶检测 miR-34a 和 MSR1之间有直接的结合位点,miR-34a 可以调控MSR1的表达水平,划痕愈合试验和Transwell侵袭试验检测过表达miR-34a后前列腺癌PC3细胞的迁移和侵袭能力受到相应的抑制,过表达MSR1后可以逆转miR-34a对前列腺癌PC3细胞的迁移和侵袭能力的抑制作用.结论:miR-34a可以通过MSR1蛋白来调控前列腺癌细胞的迁移和侵袭行为.
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MicroRNA-34 a对人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用及分子机制研究
目的：探讨MicroRNA-34a(miR-34a）对鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用及其可能的分子机制。方法：体外培养人鼻咽癌CNE-2细胞系，利用miR-34a重组质粒及Scrambled miRNA重组质粒分别构建miR-34a及阴性对照miRNA稳定转染细胞株，qRT-PCR检测细胞内miR-34a表达。选取6周龄雄性BLAB／c裸鼠15只，随机分为3组：miR-34a组(5只），Scrambled miRNA组(5只）及空白对照组(5只）。于裸鼠背部近右后肢皮下注射重组CNE-2细胞悬液，建立移植瘤模型，每7 d测定实验组与对照组肿瘤体积变化，饲养35 d后处死，完整取出肿瘤，测定肿瘤重量及终体积。提取肿瘤组织RNA及蛋白，采用qRT-PCR检测肿瘤组织中miR-34a的表达；分别采用qRT-PCR及免疫组化法检测细胞周期调控基因CDK6及抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及蛋白的表达。结果：miR-34a稳定转染CNE-2细胞后可显著提高细胞内miR-34a表达量( P＜0.05）。15只裸鼠均成功构建皮下移植瘤模型，饲养21 d后，与Scrambled miRNA组及空白对照组相比，miR-34a组肿瘤体积显著减小(P＜0.05）。饲养35 d后，miR-34a组、Scrambled miRNA组及空白对照组肿瘤平均重量分别为(0.81±0.13）g、(1.47±0.21）g、(1.58±0.37）g，肿瘤平均终体积分别为(351.37±98.19）mm3、(798.75±91.04）mm3、(849.62±101.32）mm3，miR-34a组肿瘤平均重量及肿瘤平均终体积均显著小于其余两组(P＜0.05）。 miR-34a组中miR-34a的表达量显著高于其余两组(P＜0.05）；miR-34a组中CDK6及Bcl-2 mRNA及蛋白表达量显著低于其余两组( P＜0.05）。结论：miR-34a可能通过下调CNE-2细胞内CDK6及Bcl-2的表达水平从而抑制CNE-2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，发挥其抗肿瘤作用。
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非小细胞肺癌组织miR-34 a的表达及其对H1299细胞增殖的影响
目的 观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织中miR-34a的表达情况及其对NSCLC细胞系H1299增殖的影响. 方法 RT-PCR方法检测miR-34a在NSCLC组织和NSCLC细胞系H1299中的表达情况. 克隆形成实验及MTT增殖实验检测miR-34a对NSCLC 细胞系H1299增殖能力的影响;生物信息学方法预测miR-34 a可能的功能性靶基因,并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的功能性靶基因. Western印迹检测miR-34 a对预测靶基因表达的影响. 结果 相比正常组织而言,NSCLC 组织和细胞系 H1299 中 miR-34a 表达均显著下降(P<0.05);转染 miR-34a 可显著抑制NSCLC 细胞系H1299的增殖能力(P<0.05),而转染 miR-34a 抑制剂可增加 NSCLC 细胞系 H1299 的增殖能力(P<0.05). 生物信息学预测显示Notch1是miR-34a可能的功能性靶基因,且得到荧光素报告实验结果证实. Western印迹结果显示转染miR-34a可显著抑制NSCLC 细胞系H1299中Notch1的表达. 结论 miR-34a 可通过调节Notch1的表达,进而抑制NSCLC 细胞的增殖.
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miR-34 a逆转非小细胞肺癌A549／DDP细胞对顺铂的耐药性及其机制
目的：探讨过表达miR-34a对非小细胞肺癌A549／DDP细胞顺铂（ DDP）耐药性的影响及可能机制。方法成功构建过表达 miR-34a的真核载体pCDNA3.1＋miR-34a后，将A549／DDP细胞分为对照组（无转染）、空转染组（转染空质粒）和过表达组（转染 pCDNA3.1＋miR-34a），采用实时荧光定量PCR（qPCR）法检测转染24、48、72及96 h后各组miR-34a水平；给予不同浓度DDP（2、4、8、16、32和64μg／ml）处理48 h后采用CCK-8法比较各组对DDP的敏感性，流式细胞仪PI／Annexin V双染法检测各组转染48、96 h后的凋亡率，分别采用 Western印迹检测各组转染48、96 h后常见耐药基因的表达情况。结果 A549／DDP细胞的miR-34a水平均低于其亲本细胞A549和正常支气管上皮细胞系HBE（P＜0.05）；与其余两组相比，过表达组转染后的miR-34a水平升高，且对A549／DDP细胞的增殖抑制率升高（P＜0.05）；过表达组的半数抑制浓度均低于其余两组，过表达组转染48、96 h后的凋亡率高于其余两组，而转染48 h后的P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白1及肺耐药相关蛋白的水平低于其余两组（ P＜0.05）；对照组和空转染组以上指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 A549／DDP细胞中 miR-34a水平较低，通过真核载体将其过表达后可抑制增殖率并提高其对DDP的敏感性，可能与其诱导凋亡及降低耐药基因的表达有关。
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肺癌组织中miRNA-34a表达对肺癌细胞系A549增殖和迁移的影响
目的 探讨肺癌组织中微小RNA(miR)-34a的表达情况及其对肺癌细胞系A549增殖和迁移的影响.方法 RT-PCR方法检测miR-34a在肺癌组织和肺癌细胞系A549中的表达情况.克隆形成实验检测miR-34a对肺癌细胞系A549增殖能力的影响;划痕实验检测miR-34a对肺癌细胞系A549迁移能力的影响.TargetScans软件预测miR-34a可能的靶基因,并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的靶基因.Western印迹方法检测miR-34a对预测靶基因表达的影响.结果 miR-34a在肺癌组织和肺癌细胞系A549中的表达较正常组织显著降低(P＜0.01).转染miR-34a可显著抑制A549细胞的增殖和迁移能力(P＜0.01),而转染miR-34a抑制剂可增加A549细胞的增殖和迁移能力(P＜0.01).Target Scans软件预测miR-34a可能的靶基因为B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2),且得到荧光素报告实验结果证实.Western印迹结果显示转染miR-34a可显著抑制A549细胞中Bcl-2的表达(P＜0.01),而转染miR-34a抑制剂可增加A549细胞中Bcl-2的表达(P＜0.01).结论 miR-34a可通过调节Bcl-2的表达而发挥肺癌抑制作用.
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miR-34a慢病毒表达质粒的构建及其对人结肠癌SW480细胞增殖的作用
目的 构建miR-34a慢病毒表达质粒,并检测其对入结肠癌SW480细胞增殖的影响.方法 以hsa-miR-34a前体序列pre-miR-34a为模板,设计末端部分互补的引物,进行引物退火反应,形成引物二聚体,进行PCR扩增,再以此DNA双链为模板进行PCR扩增,PCR产物酶切后,插入线性化的慢病毒载体pGIPZ-GFP中,构建重组慢病毒表达质粒pGIPZ-miR-34a,与包装质粒Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞,进行慢病毒的包装,梯度稀释法检测重组慢病毒的滴度.将包装好的重组慢病毒感染SW480细胞,qPCR法检测感染细胞中miR-34a基因mRNA的转录水平；MTT和平板克隆法检测感染细胞的增殖活力；流式细胞术检测感染细胞的细胞周期分布.结果 PCR及测序结果证实重组慢病毒表达质粒构建正确；重组慢病毒的滴度为6.52×108 TU/ml;重组慢病毒感染SW480细胞后,显著上调了细胞中miR-34a基因mRNA的转录水平,明显抑制了细胞的增殖活力(P＜0.01),G0-G1期细胞比例明显增加(P＜0.01).结论 成功构建了miR-34a慢病毒表达质粒,慢病毒感染SW480细胞后,能显著提高miR-34a的内源性表达,并抑制细胞的增殖,为进一步研究miR-34a的功能及作用机制奠定了基础.
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miR-34a在幼鼠海马神经元细胞增殖和凋亡中的作用
目的:探讨miR-34a在幼鼠海马神经元细胞增殖凋亡中的作用.方法:分离幼鼠海马神经元细胞,转染miR-34a抑制剂(miR-34a inhibitor)、抑制剂对照(inhibitor control)、miR-34a模拟物(miR-34a mimics)、模拟物对照(mimics control),RT-PCR检测细胞中miR-34a表达水平.MTT检测转染后细胞增殖情况.流式细胞仪检测细胞凋亡情况.Western blot检测细胞中Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平.结果:转染miR-34a inhibitor可以抑制miR-34a的表达,miR-34amimics可以促进miR-34a的表达.miR-34a mimics对细胞增殖抑制率明显高于mimics control组(P＜0.05),miR-34a inhibitor组抑制率明显低于inhibitor control组(P＜0.05).miR-34a inhibitor组神经元细胞凋亡率明显低于inhibitor control组(P＜0.05),miR-34a mimics组神经元细胞凋亡率明显高于mimics control组(P＜0.01),inhibitor control组和mimics control组神经元细胞凋亡率差异不显著(P＞0.05).miR-34a inhibitor组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达量低于inhibitor control组,差异显著(P＜0.05);miR-34a inhibitor组Bcl-2蛋白表达量高于inhibitor control组,差异显著(P＜0.05);miR-34a mimics组Cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达量高于mimics control,差异显著(P＜0.05);miR-34a mimics组Bcl-2蛋白表达量低于mimics control,差异显著(P＜0.05).结论:miR-34a抑制海马神经元细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax表达有关.
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miR-34a对结肠癌细胞SW480增殖、迁移和侵袭能力的影响及机制探讨
目的 探讨miR-34a对结肠癌细胞株SW480增殖、侵袭和迁移能力的影响及可能的作用机制.方法 将miR-34a过表达慢病毒、空病毒载体转染SW480细胞,未做处理细胞作为空白对照组.Real-time PCR检测各组细胞内miR-34a的表达;CCK8法检测细胞增殖能力;划痕实验、Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot实验检测细胞内E-cadherin和Vimentin蛋白表达.结果 与空病毒载体组及空白对照组相比,转染组细胞中miR-34a的表达增高,且细胞增殖效率、侵袭和迁移能力降低(P＜0.05),miR-34a使E-cadherin蛋白表达增加、Vimentin蛋白表达降低.结论 miR-34a可抑制结肠癌细胞SW480增殖、侵袭和迁移能力,并能影响E-cadherin和Vimentin的表达,miR-34a有望成为干预结肠癌转移和复发的分子靶点.
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miR-34a通过调控YY1抑制肾癌细胞的增殖及侵袭
目的 探讨miR-34a在肾癌组织中表达、miR-34a对人肾癌ACHN细胞增殖和侵袭的影响及调控机制.方法 实时聚合酶链反应(PCR)检测miR-34a在20例肾癌及癌旁组织中的表达;采用脂质体转染法将miR-34a mimics转染入肾癌ACHN细胞中,试验分空白对照组、阴性对照组、miR-34a mimics 转染组.实时PCR检测转染24 h后miR-34a表达量;噻唑蓝(MTT)试验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;Transwell及Matrigel检测细胞侵袭能力;实时 PCR和蛋白质印迹(Western blot)技术检测转染后转录因子YY1表达水平.结果 与癌旁组织相比,20例癌组织中miR-34a平均表达量为1.06±0.67,显著低于癌旁组织(1.62±0.83,P<0.01);转染后24 h,miR-34a mimics转染组的miR-34a表达量为157.04±13.01,较阴性对照组显著上调(P<0.01);miR-34a mimics转染组细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞生长被阻滞在G0/G1期;细胞侵袭能力明显减弱(P<0.01);转染miR-34a mimics后YY1基因在mRNA表达无明显变化(P>0.05),蛋白水平下调.结论 miR-34a在肾癌中低表达,可能与肾癌的发生有关;miR-34a调控YY1的表达可能是抑制肾癌细胞生物活性的重要机制之一.
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微RNA-34a在乳腺癌中的表达及其基因启动子甲基化
目的:探讨人乳腺癌组织中微RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)的表达及其临床意义,并分析miR-34a基因启动子甲基化状态与成熟miR-34a表达及患者生存的相关性.方法:采用TaqMan探针-实时荧光定量PCR法检测93例乳腺癌组织及5例良性乳腺疾病标本(作为对照)中成熟miR-34a的表达.运用EpiTect Fast FFPE Bisulfite试剂盒对石蜡包埋乳腺癌组织的基因组DNA进行抽提及亚硫酸盐修饰,然后采用甲基化特异性PCR法检测miR-34a基因启动子的甲基化状态.统计学分析miR-34a基因启动子甲基化状态与miR-34a表达量之间的关系,并用生存曲线分析其预后意义.结果:乳腺癌组织中成熟miR-34a的表达水平比良性对照组明显降低(P=0.006).miR-34a表达水平与肿瘤大小(r=-0.312,P=0.021)、淋巴结转移(r=-0.378,P=0.004)和肿瘤分级(r=-0.341,P=0.011)均呈负相关性,而与雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)等水平均不相关(P均＞0.05).miR-34a基因启动子非甲基化组的成熟miR-34a表达水平明显高于甲基化阳性单一模式组和甲基化阳性混合模式组(P值均＜ 0.001).与非甲基化组和甲基化阳性混合模式组相比,miR-34a基因甲基化阳性组的乳腺癌患者无复发生存期(P＜0.001,P=0.019)及总生存期(P=0.002,P＜0.001)均明显缩短.结论:在部分乳腺癌患者中,miR-34a基因甲基化可导致miR-34a表达下调.miR-34a基因的甲基化状态与乳腺癌的复发及不良预后相关.
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PAMAM/sh-miR-34a纳米复合物对黑素瘤细胞的抑制作用
目的 将树枝状聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)包载可以表达具有抑制人恶性黑素瘤细胞A375增殖、侵袭和转移的miR-34a的质粒sh-miR-34a,构建聚阳离子纳米复合物PAMAM/sh-miR-34a.考察形成的复合物的粒径、zeta电位、细胞摄取,以及对A375细胞的抑制作用.方法 利用粒度测定仪测定纳米复合物的粒径和电位,凝胶电泳实验测定PAMAM对sh-miR-34a的包裹能力;利用罗丹明标记的sh-miR-34a考察A375细胞对纳米复合物的摄取;CCK8法测定PAMAM/sh-miR-34a对A375细胞的抑制作用;Transwell法测定PAMAM/sh-miR-34a抑制A375细胞迁移和侵袭作用;蛋白质印迹法测定PAMAM/sh-miR-34a对A375细胞中pAkt、pRb、pERK1/2蛋白表达的阻滞作用.结果 PAMAM包裹sh-miR-34a可形成稳定的纳米复合物,在N/P=20时,细胞对PAMAM/sh-miR-34a的摄取达高(P＜0.05).PAMAM可以有效携带sh-miR-34a进入A375细胞,体外抑制A375细胞的增殖、侵袭和迁移,并且可以阻滞A375细胞中pAkt、pRb和pERK1/2蛋白的表达.结论 PAMAM可以包裹sh-miR-34a并对人恶性黑素瘤A375细胞起到抑制作用.
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辐射诱导性miR-34a的表达对细胞辐射敏感性的影响
目的 探讨miR-34a的表达与细胞、组织辐射敏感性的关系.方法 采用RT-PCR检测辐射前后不同组织、细胞中miR-34a的表达量;利用流式细胞术检测细胞凋亡率,MTT法检测细胞活力;在肿瘤细胞U87MG中转染miR-34a mimics上调miR-34a的表达并检测其细胞活力;在正常细胞HEK293中转染miR-34a inhibitors下调miR-34a的表达水平并检测其细胞凋亡率.结果 照前辐射敏感性高的细胞miR-34a表达水平高,辐射敏感性低的细胞miR-34a表达水平低;照后辐射敏感性高的细胞miR-34a表达上调幅度远高于辐射敏感性低的细胞.上调miR-34a表达水平使得肿瘤细胞U87MG照后细胞活力降低,下调miR-34a表达使得正常细胞HEK293照后细胞凋亡率降低.结论 细胞辐射敏感性与miR-34a的表达水平正相关,辐射敏感性高的细胞照后miR-34a的表达上调幅度更大;上调miR-34a表达水平对肿瘤细胞U87MG有明显的辐射增敏作用,下调miR-34a表达对正常细胞HEK293有明显的辐射防护作用.
