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60Coγ-射线诱导人白血病细胞HPRT基因突变的研究
属于电离辐射的60Coγ-射线的损伤效应早已被证实,但主要集中在对人体正常细胞或实体瘤细胞的影响方面,而有关γ-射线对人白血病细胞的损伤效应,特别是细微分子水平损伤及其生物化学进程还了解得较少.次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,简称HPRT)基因由于具有以下的特点而成为研究电离辐射致突变的较为理想的生物标记:HPRT基因是细胞存活非必需的,定位于X性染色体上,人类细胞的HRPT基因结构与序列已经清楚等.以往由于实验条件限制,主要采用放射自显影法、多核细胞检测法以及5-溴脱氧尿嘧啶核苷法,但共同的缺陷是不能进一步进行基因突变的定位与定性[1,2].因此,本研究采用单细胞克隆培养技术,观察不同剂量γ-射线对人体白血病细胞HPRT基因的影响作用,为深入研究电离辐射的致突变效应及其应用提供一定的资料.
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糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展
糖基转移酶(GT)是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶,在生物体中普遍存在,形成超基因家族.糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程,尤其在植物次生代谢途径中发挥重要作用.本文概述了糖基转移酶在植物次生代谢途径中的研究进展,描述了该基因家族及其与植物次生代谢途径进化的关系,并总结了目前糖基转移酶类基因克隆的方法和新策略.
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4'-去甲基表鬼臼毒素的酶法糖基化
4'-去甲基表鬼臼毒素(4'-demethylepipodophyllotoxin,DMEP)的糖苷衍生物具有多种药理活性,但其化学合成面临位置及立体选择性和基团的保护与脱保护等诸多挑战.该研究从库拉索芦荟Aloe barbadensis中克隆得到1个新颖糖基转移酶(glycosyltransferase, GT)基因AbGT5,并成功进行了外源表达及蛋白纯化.重组AbGT5能够催化4'-去甲基表鬼臼毒素进行糖基化,获得的产物经MS,1H-NMR,13C-NMR,HSQC以及HMBC等波谱技术鉴定为4'-去甲基表鬼臼毒素-4'-O-β-D-葡萄糖苷.酶学性质研究发现AbGT5的适反应温度为20 ℃,适pH 9.0,且不依赖金属离子.在适反应条件下,4'-去甲基表鬼臼毒素的转化率可达80%.该研究表明利用新颖糖基转移酶AbGT5可实现4'-去甲基表鬼臼毒素的高效酶法糖基化,为其糖基化提供新方法.
关键词： 糖基转移酶 酶法糖基化 工具酶 4'-去甲基表鬼臼毒素 库拉索芦荟 -
小叶女贞糖基转移酶基因的克隆和原核表达研究
根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynzUGT).该基因cDNA全长1598 bp,由66 bp 5'-UTR,1440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynzUGT),其相对分子质量和等电点分别为54826.67 Da和5.82.利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38％)、β折叠片(12.1％)和无规蜷曲(49.9％),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋.通过系统进化树分析发现,xynzUGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用.SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58370.57 Da的xynzUGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在.利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达.以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础.
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华支睾吸虫糖基转移酶基因全长序列的克隆和生物信息学分析
目的 分析和预测华支睾吸虫囊蚴全长cDNA质粒文库中编号为cs091c06的糖基转移酶基因EST序列结构和功能特征及其编码蛋白的理化性质,预测该基因的生物学意义和应用前景. 方法 利用NCBI网站和ExPaSy等生物信息学在线分析工具和Vector NTI suite等软件包,分析华支睾吸虫囊蚴全长cDNA质粒文库中cs091c06的EST序列及编码蛋白的理化性质、结构与功能特征. 结果 BLASTx工具分析该EST序列足糖基转移酶的同源基因,序列全长为1 402 bp,其完整的编码框为37～1 011 bp,编码325个氨基酸.Target P和Signal P软件预测该编码氨基酸前30个氨基酸是分泌信号肽,蛋白的理化性质较稳定.蛋白质一级结构扫描发现两个糖基转移酶的保守功能区分别位于67～178 aa和69～253 aa,且在该基因的N端发现明显的蛋白质糖基化位点,分别位于76～79 aa和190～193 aa.在该基因的氨基酸序列中,共发现8个B细胞表位和6个T细胞表位.RT-PCR结果显示,该基因在华支睾吸虫成虫阶段高表达,囊蚴和虫卵阶段低表达. 结论 华支睾吸虫糖基转移酶基因与多个物种同源,编码蛋白可能是华支睾吸虫重要的虫体分泌排泄抗原成分；阶段特异性表达特征提示该基因很可能参与华支睾吸虫重要虫源蛋白糖基化过程,可作为华支皋吸虫病疫苗候选分子和药物靶标.
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糖基转移酶活性测定方法的建立及应用
目的:建立糖基转移酶的测定方法,探讨人类血清中A、B糖基转移酶的活性,为检测酶的含量与研究酶的活性打下基础.方法:用测定糖基转移酶活性的试剂盒(glycosyltransferase activity kit)绘制适合本实验室的磷酸盐标准曲线.以该标准曲线为基础,测定已知A型、B型人血清中A、B糖基转移酶的活性.结果:绘制出适合本实验室应用的糖基转移酶测定的标准曲线:y =2671,3x-0.596,R2=0.9998;同时建立起测定人类血清中A、B糖基转移酶的方法.结论:建立的糖基转移酶活性的测定方法适用于通用型糖基转移酶活性的测定,同样适用于人类血清中A、B糖基转移酶活性的检测.
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新颖糖基转移酶对抗菌药物金霉素的糖基化修饰
目的 发掘新颖糖基转移酶并对金霉素进行糖基化修饰.方法 对来源于木立芦荟的重组糖基转移酶进行金霉素糖基化功能筛选,发现重组AaGT1能催化金霉素与葡萄糖糖基供体进行反应.放大反应液经乙酸乙酯萃取去除未反应底物,剩余含糖基化产物的水相部分采用反相半制备HPLC技术进行分离纯化.通过质谱和核磁共振波谱等技术对产物结构进行鉴定;对底物与糖基化产物的水溶性进行测定,并评价两者抑菌活性.结果 糖基转移酶AaGT1催化金霉素获得两个金霉素异构体的糖基化产物,异金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷和4-差向异金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷.异金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷的水溶性是盐酸金霉素水溶性的3.3倍;糖基化产物对金黄色葡萄球菌没有明显的抑制活性.结论 糖基转移酶AaGT1对金霉素能够进行糖基化,产物异金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷和4-差向异金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷均为新化合物,对底物进行糖基化修饰能提高其水溶性.
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UDP-糖基供体的生物合成途径分析
糖基化是生物体中重要的生化反应，它可发生于大分子化合物，如蛋白质的糖基化[1]；也可发生于小分子化合物，如各种天然产物苷元的糖基化[2]。执行化合物糖基化反应的催化酶为糖基转移酶。糖基转移酶的底物分为糖基受体和糖基供体。糖基受体可以为生物大分子化合物如蛋白质、核酸，还可以为小分子化合物如各种植物或微生物的次生代谢产物[3-5]。糖基受体通常含一些活性基团，如羟基、氨基、羧基、巯基等用于形成糖苷键，同时有少数糖基转移酶还可以催化 C-C键的形成，生成碳苷类化合物[6-7]。糖基供体为糖的活化形式，通常糖基供体中存在一个或多个高能磷酸键，这些高能磷酸键在糖基转移酶执行催化反应时能通过能量转移而形成化合物与糖的糖苷键。常见糖基供体为尿苷二磷酸糖（UDP-糖）、胸腺苷二磷酸糖（TDP-糖）、鸟苷二磷酸糖（GDP-糖）、一磷酸糖等。这些糖基供体之间可以通过不同的代谢酶进行相互转化（图1）。
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SIRT1与动脉粥样硬化相关性研究进展
一、Sirtuin基因家族
Sirtuin家族目前已发现七种同源体（ SIRT1～SIRT7），其中SIRT1是目前研究多，且结构接近酵母菌Sir2的同源体［1］。七种同源体都具有高度保守的NAD＋依赖性催化基团［1］，但是在细胞内位置各不相同。其中SIRT1、SIRT6和SIRT7定位于胞核，但也有研究表明SIRT1并不仅局限于胞核，在核外也发挥作用。 SIRT3、SIRT4和SIRT5定位于线粒体，而SIRT2主要定位于胞质［2］。 Sirtuin同源体不但在细胞内定位不同，而且蛋白功能也各不相同。 SIRT1、SIRT2、SIRT3和SIRT5是NAD＋依赖性去乙酰酶，而SIRT4和SIRT6是单ADP核糖基转移酶，无明显去乙酰基活性［2］，而SIRT7酶的活性还有待进一步研究。 -
卵巢上皮癌患者ABO血型抗原表达异常与血清糖链蛋白水平的关系
ABO血型抗原是在红细胞、内皮细胞、上皮细胞表面糖蛋白或糖脂类蛋白上发现的复杂的碳水化合物结构.A、B血型抗原的决定簇,糖蛋白和糖脂上的寡糖在ABO基因编码的糖基转移酶作用下,将特异性糖基转移到一种前体物质(H)产生A和B抗原.
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结核分枝杆菌对乙胺丁醇耐药突变基因检测方法的建立
乙胺丁醇(EMB)是一线抗结核药物,近的研究结果表明,结核分枝杆菌(结核菌)对EMB耐药的产生与阿拉伯糖基转移酶编码基因embB改变有关.其中embB基因(尤其是306位密码子)突变是产生对EMB耐药的主要分子机制.聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)是近年发展起来的常用的基因突变分析技术,结合染色法(silver staining),使其应用前景更为广阔.我们应用PCR-SSCP银染技术和PCR-直接测序法对河南省耐药监测中收集的87株结核分离株embB基因进行了研究.
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Ax新基因的序列分析及其家系的研究
目的探讨Ax亚型中国汉族家系的ABO基因的分子生物学特点.方法采用序列特异性引物聚合酶链反应扩增法对血清学定为Ax血型的家系总共5份样本做基因分型,对其中4份样本进行直接测序,发现2份有异常杂合序列,进一步采用单倍体特异性引物进行序列测定.结果这个家系中2份ABO基因序列与ABO*A101相比有3个位点发生了突变(467C>T、829G>A,1009A>G),定为Ax新基因,Genbank注册号为DQ092380.结论 829位突变导致编码ABO糖基转移酶的277位氨基酸由缬氨酸(Val)转变为甲硫氨酸(Met),很大程度上降低了A2糖基转移酶的活性.推测277位氨基酸处于ABO血型基因编码的转移酶的活性区域.
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糖基转移酶Colgalt2基因敲除对肝细胞再生过程中增殖和凋亡的作用研究
目的：初步探讨Colgalt2基因敲除对小鼠肝细胞再生过程中细胞增殖和凋亡的作用。方法根据Higgins和Anderson于1931年提出的肝大部分切除模型，实施Colgalt2＋/＋野生型对照组小鼠和Colgalt2－/－小鼠（均为C57BL/6J品系）70%肝大部分切除术（PH），分别取正常小鼠和PH后1、3、7天的小鼠再生肝脏的右外叶，于10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片。采用免疫组织化学方法比较细胞增殖核抗原（PCNA）在小鼠肝部分切除术后各时间点组间的表达阳性率差异；胶原酶两步灌注法分别分离正常和PH后1、3、5天的Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠的肝细胞。流式细胞仪检测各组肝细胞凋亡率。结果 PH后1、3、7天，Colgalt2－/－小鼠肝细胞PCNA阳性表达率显著高于Colgalt2＋/＋小鼠肝细胞PCNA阳性表达率，且差异有显著统计学意义（P＜0.01）。分离的肝细胞活细胞比率达94%，正常Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠分离的肝细胞凋亡率分别为（23.36±0.83）%、（21.04±1.16）%；PH后1天， Colgalt2＋/＋对照组小鼠肝细胞凋亡率和Colgalt2－/－小鼠肝细胞凋亡率分别为（8.27±0.33）%、（8.44±0.30）%，PH后1天肝细胞凋亡率均降至低，随即肝细胞凋亡率逐渐升高；PH后3天，Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠肝细胞凋亡率分别为（15.92±0.56）%、（12.14±0.37）%，Colgalt2－/－小鼠的肝细胞凋亡率明显低于野生型对照组小鼠的肝细胞凋亡率（P ＜0.01）；PH后5天，Colgalt2＋/＋小鼠和Colgalt2－/－小鼠肝细胞凋亡率分别为（21.36±0.51）%、（18.92±0.92）%，Colgalt2－/－小鼠的肝细胞凋亡率仍低于野生型对照组小鼠的肝细胞凋亡率（P＜0.05），肝细胞凋亡率均接近于恢复正常水平。结论糖基转移酶Colgalt2基因敲除在肝再生过程中在一定程度上具有促进肝细胞增殖和抗肝细胞凋亡的作用，提示该基因介导的胶原Glcα1，2Galβ1-糖基化修饰对肝再生可能起着重要的调控作用。
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Notch修饰相关糖基因EOGT1敲除大鼠模型的制备与基因型鉴定
目的：建立介导Notch分子O-GlcNAc糖基化修饰的糖基转移酶EOGT1基因敲除大鼠模型，为研究EOGT1功能及其在肝功能损伤中的作用奠定基础。方法通过TALEN基因敲除技术敲除EOGT1基因，获得EOGT1+/-大鼠，将EOGT1+/-大鼠杂交后获得EOGT1-/-大鼠。通过PCR凝胶电泳技术及DNA测序技术对大鼠的基因型进行鉴定。结果成功建立3种基因型（EOGT1+/+、EOGT1+/-、EOGT1-/-）大鼠的鉴定方法，通过观察发现3种基因型大鼠的外观和行为表现上无显著差异。统计大鼠出生后20天的体重发现，EOGT1+/+大鼠和EOGT1-/-大鼠的体重有显著差异（t=2.257，P=0.0343），同时还发现EOGT1-/-大鼠的生育繁殖能力降低。结论成功构建了EOGT1基因敲除大鼠模型，EOGT1基因敲除大鼠与野生型大鼠相比，体重偏低，生育繁殖能力降低。该模型的构建为研究Notch分子O-GlcNAc糖基化修饰在肝功能损伤中的作用奠定了基础。
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尿液纤维连接蛋白糖链结构在膀胱癌患者中的变化及意义
目的寻求诊断膀胱癌的检测新方法.方法收集8例膀胱癌患者术前和术后3个月(正常)尿液标本16份,提纯纤维连接蛋白(Fn),辣根过氧化物酶(HRP)标记的凝集素作探针,连接到已固定在膜上的Fn糖链,检测已结合的HRP代表Fn糖链与凝集素的结合力,增强化学发光法(ECL)检测已结合HRP的结合力.高效液相(HPLC)和荧光标记底物测定膀胱癌和癌旁正常组织N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(GnT)活力.结果用伴刀豆球蛋白凝集素(ConA)-HRP作探针时,膀胱癌尿液Fn结合力仅为正常膀胱尿液Fn的0.18,而用蔓陀罗凝集素(DSA)-HRP和麦胚凝集素(WGA)-HRP作探针时,膀胱癌组的结合力为正常组的3.34倍和3.26倍.膀胱癌患者尿液中Fn N-糖链的天线数和平分型GlcNAc结构都升高.尿Fn与WGA的结合力与病理分期、分级相关.膀胱癌组织GnT-Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的酶活力比癌旁正常组织分别增加34.0、18.1和1.6倍.结论凝集素-HRP检测分析尿液Fn的N-糖链结构改变有可能是一种简单和精确诊断膀胱癌的方法.
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胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶-磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶治疗鼻咽癌的实验研究
目的 研究胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因/5-氟胞嘧啶(fusion cytosine deaminaseuracil phosphoribosyl transferase gene/5-Flurocytosine,FCU/5-FC)对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应以及对鼻咽癌移植瘤生长的抑制作用.方法 构建表达质粒载体pcDNA3.1(-)CMVe·Egr-1·FCU,BamHⅠ酶切鉴定重组质粒,分析FCU基因和融合启动子CMVe·Egr-1的序列.电穿孔法将重组质粒转染CNE-2细胞,300 μg/ml～600 μg/mlG41 8筛选1 4天获得稳定表达FCU基因的CN E-2细胞,RT-PCR鉴定FCU基因的表达.以转染空白载体pcDNA3.1(-)的CNE-2细胞为对照,MTT法观察5-FC对表达FCU基因的CNE-2细胞生长的抑制作用,考察FCU基因的细胞旁杀效应.5×106的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,12天后将裸鼠随机分成3组:CU组,CU+PBS组和CU+5-FC组,观察不同处理对移植瘤生长的抑制作用.结果 酶切和序列分析证明重组质粒含完整的FCU基因和Egr-1启动子的核心序列,RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出330bp的预期片段.表达FCU基因的CNE-2细胞在5-FC干预下,生长受到抑制.随着表达FCU基因的细胞比例增加,细胞存活率相应地下降.CU组,CU+PBS组移植瘤体积与CU+5-FC组有显著性差异(P＜0.05).结论 表达FCU基因的CNE-2细胞可以被5-FC杀伤,FCU/5-FC系统抑制了移植瘤生长,为治疗鼻咽癌提供了新的策略.
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人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究基本策略及进展
人参、西洋参和三七等传统中药材因其广泛且良好的药理活性一直倍受关注,而人参皂苷是其主要活性成分.糖基转移酶是催化人参皂苷生物合成后一步的关键酶.人参皂苷苷元经过糖基转移酶的修饰,产生了复杂多样的人参皂苷,从而具有广泛的药理活性.目前人们已通过合成生物学技术实现了人参皂苷苷元和稀有人参皂苷compound K的合成.人参皂苷苷元的糖基化作为人参皂苷生物合成途径的后一步,是整个合成途径中重要的环节之一,近年来也取得了一些研究进展.本文介绍了人参皂苷生物合成途径中相关糖基转移酶研究的基本策略,并对相关进展进行了综述,为人参皂苷生物合成途径的深入解析及通过合成生物学途径获得人参皂苷提供理论参考.
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大环内酯糖基转移酶研究进展
在临床上得到广泛应用的大环内酯类抗生素的合成中,糖基化反应对其发挥生物功能十分重要,同时大环内酯糖基化也是一种微生物产生抗生素抗性的重要手段.这些糖基化反应是由一种被称为糖基转移酶(GTase)的蛋白催化完成的,对大环内酯GTase结构、功能和应用领域的研究将为组合生物学研究奠定坚实的基础.本文详细介绍了大环内酯糖基化的生物功能,并对大环内酯GTase的分类和发现情况作了深入讨论.随后回顾了大环内酯糖基化产生的抗性机制,并对相应的GTase MGT进行了细致的介绍.依据大环内酯GTase具有灵活底物特异性的特点,认真总结了其在组合生物学领域的应用情况.后,作者根据本课题组的相关研究成果,对大环内酯GTase的应用前景进行了展望.
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人参糖基转移酶PgUGT74AE2催化生成新型人参三醇皂苷研究
人参(Panaxginseng)来源的糖基转移酶Pg UGT74AE2能够催化原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)的C-3位羟基发生糖基化反应,生成人参皂苷Rh2,但其催化原人参三醇(protopanaxatriol,PPT)的C-3位羟基发生糖基化反应的研究至今未见报道.本研究构建重组表达质粒p ET-32a-Pg UGT74AE2,转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,获得重组菌株Transetta-Pg UGT74AE2.通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside,IPTG)诱导表达,获得重组Pg UGT74AE2.建立重组Pg UGT74AE2催化PPT的酶促反应体系,结果表明,Pg UGT74AE2能够催化PPT的C-3位羟基发生糖基化反应,生成产物3-O-β-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β,6α,12β,20S-tetraol.本研究通过酶促反应获得C-3位糖基化的新型人参三醇皂苷,可为创新药物研究提供原料.
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具有糖基转移抑制活性的抗生素研究进展
细菌细胞壁的骨架肽聚糖的生物合成过程在抗生素治疗中具有重要地位.随着细菌耐药性日益严重,糖基转移过程成为新型抗生素极有潜力的靶标.近年来,糖基转移酶的三维结构的确定,酶与抑制剂复合物结构及其相互作用的详细阐述,都为筛选和研究抑制糖基转移活性的新型抗生素提供了新的突破点.文中依照作用机制的不同,依次论述了直接抑制糖基转移酶活性的抗生素--默诺霉素及其类似物、万古霉素疏水衍生物,和作用于底物脂Ⅱ的抗生素--万古霉素和替考拉宁、雷莫拉宁、硫醚抗生素及一些推测的底物结合物,就其近年的研究进展做一综述.
