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乌司他丁通过稳定内皮连接蛋白改善基质金属蛋白酶-9导致的血管内皮细胞通透性增高
目的 探讨乌司他丁对基质金属蛋白酶-9(MMP-9)诱导的血管内皮细胞高通透性的影响及其机制.方法 离体培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),建立完整单层血管内皮细胞模型.将单层血管内皮细胞按随机数字表法分为空白对照组〔加入磷酸盐缓冲液(PBS)〕、MMP-9模型组(加入1 mg/L MMP-9)和乌司他丁组(加入1 mg/L MMP-9和1000 kU/L乌司他丁).用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖(FD40)漏出法测定单层血管内皮细胞通透性;用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养液中可溶性血管内皮细胞钙依赖性黏附素(VE-cadherin)水平;用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)和免疫荧光法测定带状闭合蛋白-1(ZO-1)、VE-cadherin和闭合蛋白-5(claudin-5)的蛋白表达水平.结果 与空白对照组比较,MMP-9组血管内皮细胞通透性显著增加〔(cm2/h,×10-2):3.35±0.56比0.94±0.06,P<0.05〕,Transwell小室上、下层小室培养液中可溶性VE-cadherin均显著增高〔上层(μg/L):5.02±0.40比3.83±0.42,下层(μg/L):4.92±1.05比3.24±1.24,均P<0.05〕,ZO-1、VE-cadherin和claudin-5的蛋白表达水平均明显降低〔ZO-1/β-actin:0.152±0.067比0.262±0.090,VE-cadherin/β-actin:0.137±0.048比0.246±0.094,claudin-5/β-actin:0.148±0.062比0.336±0.119,均P<0.05〕,其荧光图案出现明显断裂,荧光颗粒明显减少;而乌司他丁组血管内皮细胞高通透性较MMP-9模型组显著降低〔(cm2/h,×10-2):1.80±0.34比3.35±0.56,P<0.05〕;可溶性VE-cadherin脱落较MMP-9组显著减少〔上层(μg/L):4.41±0.37比5.02±0.40,下层(μg/L):3.85±1.04比4.92±1.05,均P<0.05〕,内皮连接蛋白表达较MMP-9模型组显著增加〔ZO-1/β-actin:0.229±0.097比0.152±0.067,VE-cadherin/β-actin:0.236±0.089比0.137±0.048,claudin-5/β-actin:0.262±0.101比0.148±0.062,均P<0.05〕,荧光图案的连续性和荧光颗粒均增加.结论 体外实验证明,乌司他丁通过减少VE-cadherin的脱落破坏,稳定ZO-1、VE-cadherin和claudin-5来改善MMP-9导致的血管内皮细胞高通透性.
