首页 > 文献资料
-
慢病毒介导的BAG-1L基因对缺氧状态下人神经母细胞瘤细胞的保护作用
目的 探讨慢病毒介导Bcl-2结合抗凋亡基因1L(BAG-1L)过表达对缺氧/复氧诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用,研究其对磷酸肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响.方法 体外培养SH-SY5Y细胞,取对数生长期细胞分为重组慢病毒感染组(感染携带BAG-1L基因及荧光蛋白基因的重组慢病毒)、载体对照组(感染携带荧光蛋白基因但不携带BAG-1L基因的慢病毒)及细胞对照组(未感染慢病毒).感染48 h后采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测靶细胞BAG-1L的表达;3组细胞经缺氧8 h/复氧24h处理后,采用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性;采用别藻蓝蛋白标记的膜联蛋白V/7-氨基放线菌素D(Annexin V-APC/7-AAD)双染法检测细胞凋亡,并进行流式分析;采用Western Blot试验检测细胞BAG-1L、热休克蛋白70(HSP70)、AKT及磷酸化AKT(p-AKT)的蛋白表达.结果 重组慢病毒感染48 h后可观察到外源性BAG-1L特异性蛋白条带,而细胞对照组和载体对照组无此特异性蛋白条带.经缺氧/复氧处理后,重组慢病毒感染组细胞活性较细胞对照组和载体对照组均明显增高(A值:0.689±0.036比0.425±0.013、0.400±0.012),细胞凋亡明显减少[凋亡率:(26.97±1.82)％比(36.60±1.45)％、(35.77±3.74)％],BAG-1L、HSP70、p-AKT蛋白表达水平明显升高[BAG-1L蛋白(灰度值):2.405 ±0.167比0.529±0.141、0.601 ±0.099,HSP70蛋白(灰度值):0.997±0.123比0.634±0.091、0.584±0.106,p-AKT蛋白(灰度值):1.234±0.118比0.661±0.210、0.712±0.199,均P＜0.01];而AKT蛋白表达虽高于细胞对照组和载体对照组(灰度值:1.103±0.269比0.646±0.188、0.791±0.326),但差异无统计学意义(均P＞0.05).细胞对照组和载体对照组各指标比较差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 慢病毒介导的BAG-1L基因过表达可以保护神经细胞抵抗缺氧引起的损伤,抑制细胞凋亡,其保护作用可能与促进PI3K/AKT通路的激活有关.
关键词： Bcl-2结合抗凋亡基因 神经细胞 缺氧/复氧 抗凋亡 PI3K/Akt通路 -
Bcl-2结合抗凋亡基因沉默对缺氧状态下人神经母细胞瘤细胞凋亡及热休克蛋白70表达的影响
目的 探讨Bcl-2结合抗凋亡基因(BAG-1)对缺氧/再复氧损伤后人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用,以及对热休克蛋白70 (HSP70)表达的影响.方法 取对数生长期的SH-SY5Y细胞,采用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制BAG-1表达.将筛选好的细胞分为细胞对照组、慢病毒对照组(仅含荧光蛋白的慢病毒感染组)、BAG-1小干扰RNA (siRNA)组(即BAG-1基因沉默组,感染含BAG-1基因干扰序列及荧光蛋白的慢病毒),根据沉默序列不同分为BAG-1 siRNA-α组、BAG-1 siRNA-β组.感染重组慢病毒后72 h采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测SH-SY5Y细胞中BAG-1和HSP70蛋白表达;缺氧处理后采用CCK-8测定各组细胞活性;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞HSP70转录水平.结果 慢病毒感染后72 h,Western Blot检测结果表明BAG-1 siRNA-β组干扰效果优于BAG-1siRNA-α组.各组细胞活性均随缺氧时间延长而呈先增强后减弱的趋势,且于8h时达峰值.经缺氧处理8h后,BAG-1 siRNA-β组细胞活性[吸光度(A)值]明显低于细胞对照组、慢病毒对照组及BAG-1siRNA-α组(0.59±0.09比0.94±0.12、0.90±0.11、0.91±0.14,均P＜0.01);BAG-1siRNA-β组凋亡细胞率明显高于细胞对照组、慢病毒对照组及BAG-1 siRNA-α组[(34.63±3.46)％比(14.83±3.75)％、(19.93±6.49)％、(16.40±1.18)％,均P＜0.01].BAG-1 siRNA-β组HSP70蛋白及mRNA转录水平与细胞对照组、慢病毒对照组及BAG-1siRNA-α组比较差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 BAG-1基因在缺氧神经细胞中能够发挥保护作用,减少细胞凋亡,其保护作用可以独立于HSP70基因.
-
抗凋亡基因BAG-1与肿瘤
抗凋亡基因与肿瘤的发生、发展密切相关,其通过抑制细胞的正常凋亡而延长细胞生存时间,甚至导致细胞恶变.Bcl-2结合抗凋亡基因(BAG-1基因)是一个新近发现的抗凋亡基因,其可通过与多种靶蛋白作用而发挥抑制细胞凋亡的作用.现将其与肿瘤发生、发展的关系及机制综述如下.
关键词： 肿瘤 Bcl-2结合抗凋亡基因 癌基因 细胞凋亡
