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GLT25D2基因在对乙酰氨基酚诱导肝毒性损伤中对自噬的调控作用
目的 探讨GLT25D2基因在对乙酰氨基酚(APAP)诱导的肝毒性损伤中是否对自噬有调控作用.方法 选择GLT25D2+/+野生型C57BL/6J小鼠和GLT25D2-/-基因敲除C57BL/6J小鼠为研究对象.① 体内实验:将20只野生型小鼠和20只GLT25D2-/-小鼠分别按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组和APAP干预组,每组10只.腹腔注射25 g/L的APAP溶液500 mg/kg建立小鼠肝毒性损伤模型;PBS对照组腹腔注射等量PBS.制模成功后立即处死小鼠取肝组织,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肝组织自噬相关蛋白ATG5、ATG7、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62的表达;电镜下观察肝组织超微结构改变,评估自噬水平.② 体外实验:另取野生型小鼠和GLT25D2-/-小鼠各1只,采用两步胶原灌注法提取原代肝细胞并分为两部分:一部分以5 mmol/L APAP溶液干预0、8、12 h后收集细胞,采用Western Blot试验检测肝细胞自噬相关蛋白ATG5、ATG7、LC3、P62的表达;另一部分用绿色荧光蛋白-LC3质粒(GFP-LC3)转染24 h,分别给予PBS(PBS对照组)和5 mmol/L APAP(APAP干预组)温育12 h,荧光显微镜下观察GFP-LC3阳性表达以反映自噬体的形成情况.结果 ① 体内实验结果显示:与相应PBS对照组相比,经APAP干预后,野生型及GLT25D2-/-小鼠肝组织中自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ表达下调,而负性相关蛋白P62表达上调,说明APAP处理后自噬整体水平降低.与野生型小鼠相比,GLT25D2-/-小鼠肝组织自噬正性相关蛋白ATG7、ATG5表达上调(ATG5/β-actin:1.21±0.29比0.84±0.19,ATG7/β-actin:1.29±0.14比1.54±0.40,均P>0.05),LC3-Ⅱ表达略下调(LC3-Ⅱ/β-actin:0.52±0.06比0.58±0.06,P>0.05),而负性相关蛋白P62表达下调(P62/β-actin:1.13±0.94比1.54±0.40,P>0.05),说明基因敲除后小鼠自噬表达水平高于野生型小鼠.电镜下观察超微结构显示,与相应PBS对照组相比,经APAP干预后,野生型小鼠肝组织自噬体数量无明显变化,但GLT25D2-/-小鼠自噬体数量增多.② 体外实验结果显示:随APAP干预时间延长,野生型及GLT25D2-/-小鼠原代肝细胞自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7表达逐渐上调,LC3略有波动,而负性相关蛋白P62表达逐渐下调,12 h分别达峰值或谷值,说明APAP刺激细胞自噬表达增强,并呈一定时间依赖性;与野生型小鼠相比,GLT25D2-/-小鼠12 h原代肝细胞自噬正性相关蛋白ATG5、ATG7、LC3-Ⅱ及负性相关蛋白P62表达上调(ATG5/β-actin:0.93±0.09比0.74±0.06,ATG7/β-actin:0.80±0.09比0.65±0.10,LC3-Ⅱ/β-actin:1.35±0.30比1.15±0.20,P62/β-actin:0.36±0.02比0.31±0.03,均P>0.05),说明基因敲除后自噬水平增强.荧光显微镜下观察显示,经APAP干预后,野生型及GLT25D2-/-小鼠原代肝细胞GFP-LC3阳性细胞均较PBS对照组明显增加;GLT25D2-/-小鼠GFP-LC3阳性细胞比例明显高于野生型小鼠(0.64±0.08比0.36±0.05,P<0.05).结论 GLT25D2是自噬负性调控因子,敲除GLT25D2基因能够增强APAP诱导肝毒性损伤小鼠的自噬水平.
