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Ac-SDKP对AngⅡ诱导的大鼠血管外膜成纤维细胞胶原合成的调节作用
目的:探讨抗纤维化短肽N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)经由AngⅡ介导的细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)的调节通路在大鼠血管纤维化形成中的作用.方法:采用差速贴壁法获取新生大鼠血管外膜成纤维细胞,随机分为对照组,AngⅡ(10-6 mmol/L)组,AngⅡ+Ac-SDKP(10-9 mmol/L)组和PD98059(细胞外信号调节激酶通路特异性抑制剂)(25μmmol/L)组,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA表达,Western blot印迹法检测MMP(基质金属蛋白酶)-2、TGF(转化生长因子)-β1蛋白的表达.结果:Ac-SDKP能显著抑制AngⅡ刺激的胶原蛋白合成和TGF-β1蛋白表达,并上调MMP-2表达.ERK1/2通道特定阻断剂(PD98059)则明显减弱Ac-SDKP的上述作用.结论:Ac-SDKP可能是通过ERK1/2信号转导通道抑制AngⅡ刺激的胶原蛋白合成,从而发挥有效的抗血管纤维化作用.
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Ac-SDKP在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠中作用机制的探讨
目的 探讨小鼠肺间质纤维化模型中,Ac SDKP通过抑制内质网应激进而干预上皮-间质转化过程而延缓肺纤维化发展的机制.方法 将24只9周龄健康雄性C57BL/6小鼠[体质量(25±2)g]随机分为3组:对照组(N组)、肺纤维化模型组(M组)、肺纤维化+Ac-SDKP组(P组),每组8只.选取其中16只小鼠,采用气管内注入博莱霉素(5 mg/kg)法建立小鼠肺纤维化模型,21d后随机选取8只纤维化小鼠,腹腔内埋入Ac-SDKP微量注射泵,持续干预21 d.于各组造模21 d后处死小鼠,取肺组织,观察肺组织病理学变化;测定羟脯氨酸含量,判断造模是否成功并评估肺组织纤维化严重程度;Western blot、免疫组化法检测内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP,间质组织标志物α-SMA、Vementin,上皮组织标志物E-cadherin蛋白表达水平.结果 ①肉眼观察:N组双肺表面及切面光滑,未见结节形成;M组双肺表面及切面均可见散在结节性病变;P组肺组织表面也可见小结节,但较M组稀少.②HE及Masson染色:M组出现明显的纤维化改变;P组与M组相比,肺泡炎及肺纤维化的程度均有所减轻(P＜0.05).③羟脯氨酸含量测定:M组较N组含量升高;P组较M组含量降低,P组较N组含量仍有所升高(P值均＜0.05).④免疫组化结果:N组肺组织中αSMA、Vimentin、CHOP及GRP78少量表达,M组表达较N组明显增加,P组较M组表达减少,但仍多于N组(P值均＜0.05);N组肺组织中E-cadherin表达较多,M组表达较N组减少,P组较M组表达增加,但少于N组(P值均＜0.05).⑤Western blot结果:与N组比较,M组CHOP、GRP78、Vimentin蛋白相对表达量均升高,E-cadherin蛋白相对表达量降低;而P组各蛋白相对表达量均介于N组和M组之间(P值均＜0.05).结论 在肺纤维化发病过程中,Ae-SDKP可能通过抑制内质网应激减缓上皮-间质转化,从而发挥其抗肺间质纤维化的作用.
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抗器官纤维化多肽N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸研究进展
器官纤维化是多种疾病终末期的共同病理变化,可导致器官功能衰竭.近年来有关N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(N-acetylseryl-aspartyl-lysyl-proline,Ac-SDKP)在抗器官纤维化方面的作用引起了学术界的关注.Ac-SDKP是由赖氨酸寡肽酶水解其前体胸腺素β4而产生的内源性四肽,在哺乳动物组织中普遍存在[1].研究表明,血管紧张素转化酶抑制剂能够增加血浆和组织中Ac-SDKP浓度[2],肾单位可释放Ac-SDKP[3].早期研究发现Ac-SDKP具有抑制造血干细胞生长的生物学功能,其后大量研究结果表明Ac-SDKP具有抗炎和抗纤维化作用,对各原因所致的器官纤维化,包括肺纤维化、心肌纤维化、肾纤维化、肝脏纤维化等均具有抑制作用[4-6].现就有关Ac-SDKP在抑制心脏纤维化、肾纤维化和硅肺纤维化方面的研究进展综述如下.
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Ac-SDKP通过调节HDAC6和HSP90抑制矽肺纤维化的机制研究
目的 探讨Ac-SDKP通过对组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)、热休克蛋白90(HSP90)的调节,抑制大鼠矽肺纤维化的作用机制.方法 非暴露式支气管内灌注法复制大鼠矽肺模型,分为对照4周组、矽肺模型4周组、对照8周组、矽肺模型8周组、Ac-SDKP抗纤维化治疗组和Ac-SDKP预防治疗组.采用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导原代培养新生大鼠肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,并予以Ac-SDKP和HDAC6特异性抑制剂TCS HDAC620b预处理.采用苏木精-伊红染色法观察病理形态变化,免疫组织化学法、Western blot检测Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、HDAC6及HSP90的表达.结果 免疫组织化学法结果显示,HDAC6和HSP90阳性表达主要位于矽结节内,给予Ac-SDKP抗纤维化治疗或预防治疗均能抑制Ⅰ型胶原、α-SMA、HDAC6及HSP90蛋白表达的上调.而TGF-β1能诱导大鼠成纤维细胞 α-SMA阳性表达,同时伴随HDAC6和HSP90蛋白表达上调,而予以TCS HDAC620b或Ac-SDKP预处理均能抑制该变化.结论 Ac-SDKP能够通过对HDAC6和HSP90信号的调节,在体内外抑制矽肺大鼠肌成纤维细胞分化和胶原沉积,从而发挥抗矽肺纤维化的作用.
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化学合成的Ac-SDKP类似物FAM-Aca-SDKP与HSC-T6细胞表面结合特征分析
目的 利用化学合成N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(Ac-SDKP)类似物FAM-Aca-SDKP,探讨Ac-SDKP与肝星状细胞株(HSC-T6细胞)的结合及其结合的基本物理特征.方法 化学合成携带绿色荧光的Ac-SDKP类似物短肽[5-FAM]-酪氨酸-氨基己酸-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸(FAM-Aca-SDKP),实时定量PCR检测其对HSC胶原分泌影响验证其生物学效应与Ac-SDKP一致性,采用荧光显微镜观察FAM-Aca-SDKP与HSC-T6结合,采用流式细胞术检测FAM-Aca-SDKP与HSC-T6结合的时间-浓度效应.据资料不同采用t检验或秩和检验进行统计学分析.结果 不同浓度的Ac-SDKP及FAM-Aca-SDKP与HSC-T6孵育24 h后,均观察到HSC-T6表达Ⅰ型前胶原增加,而作用时间为0.5h时,Ac-SDKP和FAM-Aca-SDKP导致Ⅰ型胶原表达分别下降30％ ～ 50％;FAM-Aca-SDKP与HSC-T6共孵育后,在荧光显微镜下观察到细胞表面出现显著绿色荧光,给予Ac-SDKP竞争抑制可显著减少细胞表面的荧光强度;流式细胞术检测显示,在FAM-Aca-SDKP浓度为0 ～ 50 μ mol/L时,荧光阳性细胞率从0快速上升至约12％,而在浓度为50 ～ 100μ mol/L,阳性细胞率仅从约12％上升至约14％,并且给予Ac-SDKP共孵育可显著降低阳性细胞百分率;FAM-Aca-SDKP阳性细胞数在孵育45 min达到高峰,随后逐渐降低. 结论 FAM-Aca-SDKP可结合于HSC-T6细胞表面,表现出竞争性抑制、可饱和、时间-浓度效应等配体-受体结合特征.
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Ac-SDKP通过抑制内质网应激对肺纤维化细胞凋亡的影响
目的 探讨体内、外肺间质纤维化模型中Ac-SDKP延缓肺纤维化发展的可能机制.方法 体内实验:将24只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(8只)、肺纤维化模型组(8只)、肺纤维化+Ac-SDKP治疗组(8只).采用气管内注入博来霉素(5 mg/kg)法建立小鼠肺纤维化模型,对照组为气管内注入等体积0.9%氯化钠溶液.造模后肺纤维化+Ac-SDKP治疗组小鼠腹腔内埋入Ac-SDKP微量注射泵(Ac-SDKP 800μg·kg-1·d-1,冰乙酸0.1 mol/L,卡托普利100 mg·kg-1·d-1),持续干预21 d.对照组及肺纤维化模型组小鼠均于造模完成后第21天处死,肺纤维化+Ac-SDKP治疗组小鼠于干预21 d后处死,取肺组织观察其病理学变化;按试剂盒说明测定羟脯氨酸含量测定;TUNEL法测定肺泡上皮细胞凋亡率;Western-blot、免疫组化法检测GRP78、CHOP蛋白及mRNA的表达水平.体外实验:培养A549细胞,经TGF-β干预24 h后收集细胞,RT-PCR检测GRP78、CHOP mRNA的表达水平.正态分布计量资料多组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验;非正态分布计量资料多组间比较采用kruskal-WallisH检验.结果 (1)一般观察:对照组小鼠双肺表面及切面光滑,未见结节形成;肺纤维化模型组肺组织表面及切面可见散在小结节;肺纤维化+Ac-SDKP治疗组肺组织表面也可见小结节,但较肺纤维化模型组稀少.(2)HE及Masson染色:肺纤维化模型组出现明显的纤维化改变,肺纤维化+Ac-SDKP治疗组肺纤维化程度有所减轻.(3)羟脯氨酸含量:3组间羟脯氨酸含量差异有统计学意义(H=20.490,P<0.01),其中肺纤维化模型组、肺纤维化+Ac-SDKP治疗组明显高于对照组(q=0.517、0.167,P<0.05),肺纤维化+Ac-SDKP治疗组明显低于肺纤维化模型组(q=0.351,P<0.05).(4)肺泡上皮细胞凋亡指数:3组间差异有统计学意义(F=57.720,P<0.01),其中肺纤维化模型组、肺纤维化+Ac-SDKP组明显高于对照组(q=8.471、3.639,均P<0.01),肺纤维化+Ac-SDKP组明显低于肺纤维化模型组(q=4.832,P<0.01).(5)CHOP、GRP78蛋白水平表达:肺纤维化模型组、肺纤维化+Ac-SDKP治疗组较对照组明显下降(q=22.630、8.921,138.812、41.233;P<0.01),肺纤维化+Ac-SDKP治疗组较肺纤维化组明显升高(q=13.711、97.583,P<0.01).(6)GRP78、CHOP mRNA表达量:TGF-β干预组较对照组明显升高(q=8.791、7.782,P<0.05);TGF-β+Ac-SDKP干预组较单纯Ac-SDKP干预组明显升高(q=4.399、5.561,P<0.05).结论 Ac-SDKP可能通过抑制内质网应激减缓肺泡上皮细胞凋亡,从而发挥其抗肺间质纤维化的作用.
