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植物异戊二烯生物反应器研究进展
异戊二烯类化合物是一种在自然界广泛存在的植物次生代谢产物.异戊二烯类化合物在植物中扮演着重要角色,既参与植物的生长发育过程,也参与调节植物与环境之间的关系.同时,异戊二烯类化合物在农业、医药、化工等多个领域中也具有重要价值.许多高价值的异戊二烯类化合物在自然界中的产量很低,限制了对其的研究利用.目前,利用植物生物反应器来调控异戊二烯类化合物的合成是生命科学的研究热点之一.在不断深入研究异戊二烯类化合物合成代谢途径的同时,开发利用了植物生物反应器生产异戊二烯类产物的技术,这些生产技术的开发又反过来推动对异戊二烯类化合物合成代谢途径的深入了解.综述了植物异戊二烯类化合物的合成、调控及异戊二烯生物反应器的研究进展,以期为促进其生物合成提供参考.
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唑来膦酸抗肿瘤作用的研究进展
唑来膦酸作为第三代双膦酸盐药物已广泛用于恶性实体瘤骨转移相关事件的防治.进一步研究发现,唑来膦酸可通过抑制甲羟戊酸途径中焦磷酸合酶的活性,使异戊烯焦磷酸大量蓄积,同时异戊烯焦磷酸与细胞内一磷酸腺苷结合形成三磷酸腺苷分解类似物蓄积于细胞中,从而改变细胞周期蛋白和凋亡蛋白水平,抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡,具有一定的直接和/或间接抗肿瘤作用.有关肺癌、乳腺癌、前列腺癌及肝癌等前期临床试验提示唑来膦酸与细胞毒药物、内分泌药物及靶向药物联合具有一定程度的协同抗肿瘤作用,并且在抗肿瘤药物之后序贯应用效果更好.一些相关的临床试验正在进行中.
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三种不同抗原对小鼠γδT细胞体外扩增的比较
目的 比较异戊烯焦磷酸(IPP)、热休克蛋白70 (HSP70)和表位肽(EP6)对小鼠脾脏γδT细胞体外扩增的差异.方法 2011年1月-2015年5月于北京协和医院及北京世纪坛医院选取健康雄性SPF级C57 BL/6小鼠32只,分为16组,每组2只.提取并分离小鼠脾脏γδT细胞,分为对照组、IPP组、HSP70组和EP6组,每组再按浓度及干预方式(连续性刺激及单次刺激)的不同进行分组,IPP浓度分为1.25 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml,HSP70浓度分为6.25 μg/ml、12.5 μg/ml、25μg/ml,EP6浓度分为0.05 μg/μl、0.1 μg/μl、0.2μg/μl,连续性刺激即每隔2～3日换液50％并补充所换液体中相应的抗原,单次刺激组即不需补充所换液体中的抗原,共培养10 d.检测对照组与不同浓度抗原、不同干预方式在培养的第0天(D0)、第3天(D3)、第7天(D7)和第10天(D10)的γδT细胞比例.结果 不同浓度的抗原作用γ趼细胞后第3天出现扩增峰值,达峰时抗原由小到大各浓度的增殖百分比分别为:IPP组(5.46％±0.01％、5.23％±0.01％、5.08％±0.08％),HSP70组(7.43％±0.11％、4.48％±0.07％、7.78％±0.07％),EP6组(3.80％±0.10％、6.22％±0.13％、8.42％±0.11％).达峰时IPP组1.25 ng/ml的扩增效果较2.5ng/ml和5.O ng/ml明显升高(5.46％ ±0.01％ vs.5.23％±0.01％、5.08％±0.08％,P＜0.05).3组γδT细胞的扩增效果不随抗原浓度增加而升高,随培养时间的延长而降低.浓度不变干预方式不同时,连续性刺激组和单次刺激组均在第3天出现扩增峰值,连续性刺激组第3天的增殖百分比分别为:IPP组6.38％±0.58％、HSP70组4.27％±0.26％、EP6组5.41％±0.11％;单次刺激组第3天的增殖百分比分别为:IPP组3.60％±0.27％、HSP70组4.54％±0.16％、EP6组3.20％±0.11％;达峰时IPP组和EP6组均出现连续性刺激组扩增百分比大于一次性单次刺激组(P＜0.05).结论 小鼠模型中抗原体外扩增脾脏γδT细胞时,培养后第3天为扩增的达峰时间,且抗原连续性刺激扩增效果优于单次刺激.
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γδT细胞诱导与分化的初步研究-Ⅰ
目的:探讨在异戊烯焦磷酸(IPP)作用下,健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞的增殖和亚型变化,以期获得足够的具有不同特征的γδT细胞用于后续的实验研究.方法:流式细胞术分析经IPP诱导的单个核细胞表面分子的表达状态,评估其γδT细胞的比例、亚型和表型格局.结果:健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞数量虽占较低比例,但两者的γδT细胞存在显著异质性.健康人外周血γδT细胞主要以Vγ9Vδ2 TCR亚群为主;初始分选的外周血单个核细胞中Vγ9Vδ2T细胞主要为中央记忆型(CD27~+CD45RA~-)和效应记忆型(CD27~-CD45RA~-);IPP诱导后,γδT细胞显著扩增,VγVδ2 T细胞亚群转变为以效应记忆型为主,并高表达HLA-DR和B7分子.而新生儿脐带血来源的γδT细胞却呈现出较为复杂的亚群异质性,其Vγ9Vδ2 T细胞主要为CD27~+CD45RA~+的幼稚型细胞;经IPP诱导14天后,γδT细胞获得扩增(比例增高)且Vγ9Vδ2 T细胞趋向中央记忆型和效应记忆型分化,但仍以幼稚型为主.结论:健康人外周血和新生儿脐带血中γδT细胞在数量、亚群诸方面存在差异;IPP具有诱导和扩增外周血γδT细胞的牛物学作用,而脐带血来源的γδT细胞还需相关细胞因子的协同作用,才能呈现出其分化成熟为可用于理论研究和临床实验的效应记忆型γδT细胞的潜能.关于其具有的免疫调节和效应功能将另文报道.
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异戊烯焦磷酸扩增成人外周血以及脐带血γδT细胞效能比较
目的:研究异戊烯焦磷酸(IPP)扩增成人外周血以及脐带血γδT细胞效能比较.方法:梯度离心法分离成人外周血以及脐带血淋巴细胞,分别加入IL-2和IPP,在10%小牛血清的RPMI-1640培养体系下,刺激培养不同时间,用流式细胞仪检测2种标本被刺激后γδT细胞增殖比例.结果:IL-2加IPP扩增后成人外周血γδT细胞在淋巴细胞中比例上升为73.05%±2.92%;脐带血组扩增后γδT细胞在淋巴细胞中比例上升为38.66%±5.14%;不同来源的γδT细胞的在相同质量分数和时间刺激下扩增的效率有显著性差异.相同的扩增条件下,成人γδT细胞增殖峰值在第14天,而足月儿的扩增峰值延迟到第18天.结论:脐带血来源的γδT细胞对IPP抗原刺激反应较弱,可能是新生儿早期天然免疫力低下的原因之一.
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不同磷酸化合物扩增外周血γδT细胞的效率及条件优化
目的 研究异戊烯焦磷酸(IPP)与帕米磷酸钠(PAM)体外扩增成人外周血γδT细胞的效率及条件优化.方法 梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),分别加入(1.0、5.0、10.0、15.0) μg/mL IPP或(2.0、5.0、8.0、12.0) μg/mL PAM及(100.0、200.0、500.0) IU/mL IL-2,置于100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养体系培养,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后CD3+ TCRδ2+的γδT细胞数量以及比例,并计算其扩增效率.结果 经过14 d扩增培养后,IPP组的γδT细胞数量在淋巴细胞中比例可上升为81.3％,PAM组的γδT细胞数量在淋巴细胞中比例上升为78.5％,表明IPP和PAM均能有效刺激扩增γδT细胞,2组的扩增效率无统计学差异(P＞0.05).结论 PAM具有与IPP相似的体外扩增γδT细胞的能力,PAM扩增法可能成为扩增γδT细胞更为经济实用的选择.
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一种体外扩增人γδT细胞的新方法
目的:建立一种简单快速的体外扩增人外周血γδT细胞的方法, 以便进一步对γδT细胞生物学特性和肿瘤免疫治疗的研究.方法:取健康人外周血100 mL, 分离单个核细胞, 置于含100 mL/L小牛血清, 50 mL/L人AB血清, 异戊烯焦磷酸(2 μg/L)和IL-2(100 IU/mL)RPMI1640 培养液中培养, 进行细胞毒杀伤活性测定和流式细胞术分析.结果:细胞培养10 d时γδT细胞从扩增前4.21%增加到70.35%, 增殖倍数可达80倍, 悬浮生长γδT细胞CD44表达为86.39%、贴壁生长γδT细胞为94.0%.效靶细胞比为40: 1时, 对K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞的杀伤活性分别为75%和61%.结论:用一种简单、快速和特异性的体外扩增人外周血中γδT细胞新方法, 培养的γδT细胞具有较强的抗肿瘤活性.
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比较不同磷酸抗原体外扩增前列腺癌患者外周血γδ T细胞的效率
目的:研究唑来膦酸(Zoledronate acid)和异戊烯焦磷酸(IPP)体外扩增前列腺癌患者外周血中γδ T细胞的效率.方法:密度梯度离心法分离外周血中单个核细胞(PBMCs),分别加入5.0 μmol/L Zol 或10.0 μg/ml IPP联合1 000 IU/ml的rhIL-2于含10%自体血浆的AIM-V培养体系培养,观察并收集细胞,采用流式细胞仪检测刺激后 CD3+Vγ9+的γδ T细胞数量和比例,并计算其扩增效率.结果:经14天扩增培养后,两种磷酸抗原均能在体外扩增前列腺癌患者外周血中的γδ T细胞,Zol组的γδ T细胞在淋巴细胞中高含量达64.7%,IPP组高达55.9%,且扩增培养至第9天的γδ T细胞对肿瘤细胞有一定的杀伤活性,但Zol组的扩增效率以及细胞的杀伤活性均明显强于IPP组(P<0.05).结论:Zol具有与IPP体外扩增外周血中γδ T细胞的能力,Zol刺激法可能成为体外扩增前列腺癌患者外周血中γδ T细胞更为经济安全的选择.
