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沉默HepG2细胞核糖核酸酶抑制因子的shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定
目的 构建针对人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的shRNA逆转录病毒载体,为探讨hRI抗肿瘤作用机制打下基础.方法 用亚克隆法将目的片段pkd-dsRI和pkd从表达载体pKD-dsRI克隆到pLNCX上,用双酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中,用800 mg/L G418筛选2周,产生稳定的细胞克隆后,用RT-PCR检测细胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表达的变化.结果 双酶切鉴定为阳性克隆.RT-PCR表明,对比空白组(0.790±0.014)和空载体组(0.904±0.027),干扰组hri基因表达(0.361 ±0.048)明显下调,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建了针对hRI的shRNA逆转录病毒载体.
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 shRNA 逆转录病毒载体 构建 -
siRNA干扰人核糖核酸酶抑制因子在HeLa细胞中的表达鉴定
目的：鉴定已构建的干扰人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的siRNA表达载体pKD-dsRI的干扰效果。方法用脂质体法将所构建的pKD-dsRI与充当报告基因的重组绿色荧光蛋白融合hRI的逆转录病毒载体(pLNCX-EGFP-C1-hri)共转染到人宫颈癌HeLa细胞中。实验设4组院空白细胞组(未转染组)、pLNCX-EGFP-C1-hri转染组(对照组1)、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组(对照组2)及pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组(干扰组)。采用RT-PCR和Western blotting检测egfp-hri基因在转录后基因水平和蛋白质水平的表达。结果干扰组egfp-hri基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平较对照组1与对照组2分别下降了91%、85%和83%、81%(P<0.05)。结论已成功构建了针对hRI的siRNA表达载体。
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 siRNA 鉴定 -
人核糖核酸酶抑制因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的 构建含有人核糖核酸酶抑制因子(hRl)基因的重组腺病毒载体.方法 以含有全长cDNA的pT7-RI为模板,PCR扩增hRI,经T载体克隆后,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183细菌内和pAdEasy-1同源重组.筛选阳性克隆,酶切、PCR及测序鉴定,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增.通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的 基因等方法鉴定重组的腺病毒.结果 酶切鉴定及PCR结果证明hRI基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为1.5×10<'10>pfu/ml.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含hRI,基因的重组腺病毒载体.
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 腺病毒载体 基因治疗 -
绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子表达载体pEGFP-C1-hri的构建及鉴定
目的 构建表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的表达载体pEGFP-C1-hri,为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用的分子机制打下基础.方法 用亚克隆法,将目的片段从表达载体pGEX-6p-1-hri克隆到pEGFP-C1上,用双酶切筛选得到阳性重组质粒pEGFP-C1-hri,用脂质体法将其瞬时转染到小鼠黑色素瘤细胞B16中,在荧光显微镜下检测其表达.结果 pEGFP-C1-hri中插入了hri序列,绿色荧光高效表达于B16细胞浆中.结论 pEGFP-C1-hri表达载体已成功构建.
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 绿色荧光蛋白 载体 构建 -
靶向人核糖核酸酶抑制因子双抗性的 shRNA 逆转录病毒载体构建及鉴定
目的：构建靶向人核糖核酸酶抑制因子（ hRI）新霉素-潮霉素B双抗性的shRNA逆转录病毒载体，为探讨人核糖核酸酶抑制因子抗肿瘤作用机制提供依据。方法用亚克隆法，将潮霉素B抗性基因hygr从载体pIRES-hygr2克隆到pLNCX-pKD-dsRI-neor与pLNCX-pKD-neor 上，用酶切筛选得到阳性重组质粒pLNCX-pKD-dsRI-neor -hygr与pLNCX-pKD-neor -hygr。转染时设干扰组、空载体组和空白组。用脂质体法将pLNCX-pKD-dsRI-neor （干扰组）、pLNCX-pKD-neor -hygr （空载体组）转染到人肝癌细胞SMMC77细胞中，未处理的细胞作空白组，用400 mg/L G418和200 mg/L潮霉素B筛选3～4周产生稳定的细胞克隆后，用Western blotting检测细胞中核糖核酸酶抑制因子表达的变化。结果酶切结果证明重组质粒构建成功；Western blotting表明，与空白组（0．1810±0．015）和空载体组（0．1951±0．027）相比，干扰组RI表达（0．0311±0．048）明显下调（P＜0．05）。结论成功构建的靶向人核糖核酸酶抑制因子新霉素-潮霉素B双抗性的shRNA逆转录病毒载体能下调RI基因的表达。
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 shRNA 逆转录病毒载体 -
荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子基因在人肝癌细胞中的表达
目的：探讨重组绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子（ RI）的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri在肝癌细胞中的表达。方法用脂质体法将所构建的重组载体pLNCX-EGFP-C1-hri转染到人肝癌HepG2细胞中，用600 mg/L G418筛选2周后采用RT-PCR和Westen blot检测pLNCX-EGFP-C1-hri表达。结果在HepG2细胞中，pLNCX-EGFP-C1-hri在基因转录水平和蛋白质水平均高效表达（P均＜0．01）。结论本研究成功构建重组绿色荧光蛋白融合人RI的逆转录病毒载体。
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 逆转录病毒载体 绿色荧光蛋白 癌 肝细胞 -
人核糖核酸酶抑制因子的 shRNA逆转录病毒载体的鉴定
目的：鉴定构建的针对人核糖核酸酶抑制因子（ RI）的shRNA逆转录病毒载体。方法用脂质体法将针对人RI的shRNA逆转录病毒载体转染到人肝癌细胞SMMC7721中，用800 mg/L G418培养3～4周筛选产生稳定的细胞克隆，用RT-PCR和Western blot检测细胞中RI mRNA和蛋白的表达。结果 RT-PCR 和Western blot 表明，RI表达明显下调（ P＜0．05）。结论成功构建了针对人RI的shRNA逆转录病毒载体。
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 shRNA 逆转录病毒载体 构建 -
过表达人RI抑制人膀胱癌T24细胞的侵袭、转移及EMT发生
目的 检测过表达人核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)基因的质粒pIRES2-EGFP-RI对人膀胱癌T24细胞侵袭转移及上皮细胞间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)现象的影响.方法 将连有RI的质粒pIRES2-EGFP-RI稳定转染T24细胞后利用G418筛选出阳性克隆.根据转染的质粒不同分为3组:T24组(未转染组)、T24-0(转染pIRES2-EGFP质粒)和T24-RI组(转染pIRES2-EGFP-RI质粒).RT-PCR检测T24细胞中RI的mRNA 水平变化,细胞免疫荧光及Western blot检测RI蛋白的表达,利用HE染色观察其细胞形态的变化,Transwell方法检测细胞侵袭及转移能力的变化,Western blot检测侵袭转移及EMT相关蛋白Twist、MMP-9和Snail及E-cadherin的表达,构建移植瘤模型,利用HE染色观测肺组织切片癌细胞转移情况,组织免疫化学方法检测移植瘤中RI、Twist、Snail及E-cadherin 的表达.结果 T24-RI组人RI的mRNA水平及蛋白表达显著升高(P＜0.05)；HE染色结果表明细胞铺展良好,核质比明显减小,细胞由间质形态向上皮形态转变；Transwell方法显示T24-RI组细胞的侵袭及转移能力较T24组、T24-0组明显下降；Western blot结果表明T24-RI组Twist、MMP-9和Snail较T24组、T24-0组显著降低(P＜0.01),E-cadherin较T24组、T24-0组显著升高(P ＜0.01)；HE染色肺组织切片显示T24-RI组较其他两组癌细胞转移降低,组织免疫化学结果表明T24-RI组RI、E-cadherin蛋白明显升高,而Twist、Snail显著降低.结论 过表达人RI载体提高了RI蛋白的表达水平,并抑制了人膀胱癌T24细胞EMT的发生,从而抑制了膀胱癌T24细胞的侵袭、转移.
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 T24细胞 细胞转移 细胞侵袭 EMT -
增强型绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子包装细胞系的建立及鉴定
目的：建立及鉴定产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子(hRI)的PA317包装细胞系。方法：采用脂质体转染法将pLNCX-EGFP-C1-hRI质粒转染至PA317包装细胞，分为空白细胞组(未转染组)、pLNCX-EGFP-C1转染组(对照组)、pLNCX-EGFP-C1-hRI转染组(实验组)，每组设3个复孔，转然后用RT-PCR和Western blot方法检测egfp-hRI基因在PA317细胞的表达。结果：RT-PCR和Western blot方法显示，转染后在PA317细胞中检测到egfp-hRI基因表达；用脂质体转染法获得了G418阳性的PA317包装细胞克隆。结论：实验成功建立了产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的PA317包装细胞系，为后续试验奠定了基础。
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 增强型绿色荧光蛋白 鉴定 -
绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子病毒感染NIH3T3细胞的研究
目的：鉴定NIH3T3细胞中绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子基因(egfp-hRI)的表达情况。方法：采用上清感染法，将产生绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子反转录病毒的PA317细胞上清感染NIH3T3细胞，使反转录病毒介导的绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子载体(pLNCX-EGFP-C1-hRI)稳定整合于NIH3T3细胞。用荧光显微镜检测目的基因的表达，采用蛋白质印迹(Western blot)法检测目的基因在NIH3T3细胞的表达。结果：在荧光显微镜下可见绿色荧光在细胞浆内表达，Western blot法检测到目的基因表达。结论：建立表达绿色荧光蛋白融合人核糖核酸酶抑制因子的NIH3T3细胞株。
关键词： 人核糖核酸酶抑制因子 感染 绿色荧光蛋白
