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组蛋白H4第20位赖氨酸突变阻滞细胞周期
目的 研究组蛋白H4第20位赖氨酸突变对细胞可能存在的影响并探究其分子机制,期望寻找作用于该位点的特异性蛋白,比如H4K20me3去甲基化酶.方法 建立能够表达羧基(C)末端带Flag-HA标签的组蛋白H4及其突变体H4K20M(赖氨酸突变为蛋氨酸),H4K20A(赖氨酸突变为丙氨酸)的HeLa S3细胞系.通过病毒感染法获得能够表达目的蛋白的细胞,碘化丙啶(PI)染色后进行流式细胞(FAGS)周期分析.制备单个核小体(mono nucleosome,mono-N),通过免疫共沉淀的方法得到相互作用蛋白复合物成分,银染观察蛋白组分的差异,将差异蛋白条带切割后进行质谱分析.结果 在病毒感染大约72h过表达K20M的HeLa S3细胞表型异常,主要表现为细胞体积和细胞核体积明显增大,并停止生长,不再分裂.FACS结果显示过表达H4K20M的细胞被阻滞在G2/M期,质谱结果表明在过表达K20M的细胞中RBBP4/7的表达量增高.结论 组蛋白H4第20位赖氨酸突变为蛋氨酸会阻滞细胞周期,而这种阻滞很可能由RBBP4/7所引起.
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赖氨酸甲基转移酶PR-Set7在亚砷酸钠致人永生化皮肤角质形成细胞DNA损伤中的作用
目的 探讨组蛋白甲基转移酶PR-Set7在亚砷酸钠致人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)DNA损伤中的作用机制.方法 将处于对数生长期的HaCaT细胞暴露于含终浓度分别为0(对照)、1.25、2.5、5、10 μmol/L亚砷酸钠的DMEM高糖培养基染毒24 h.采用MTT法测定HaCaT细胞的存活情况.另设对照(24h)组、亚砷酸钠(10 μmol/L,24 h)染毒组、PR-Set7小干扰RNA干扰组(SiPR-Set7,50 nmol/L,48 h)和联合暴露(50 nmol/L SiPR-Set7干扰48 h后,10 μmol/L亚砷酸钠暴露24 h)组.分别采用qRT-PCR法检测PR-Set7 mRNA的表达水平,采用Western blot法检测H4K20mel和PR-Set7蛋白的表达水平,采用单细胞凝胶电泳法检测DNA损伤水平.结果 与对照组相比,5、10 μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞的存活率均较低,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,5、10 μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞PR-Set7蛋白和mRNA的表达水平均升高,而H4K20me1蛋白的表达水平降低;2.5、5、10 μmol/L亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞尾部DNA％及尾矩升高,差异有统计学意义(P＜0.05).随着亚砷酸钠染毒浓度的升高,HaCaT细胞PR-Set7蛋白和mRNA的表达水平均呈上升趋势,而H4K20me1蛋白和mRNA的表达水平呈下降趋势,DNA损伤水平(尾部DNA％及尾矩)呈上升趋势.与对照组比较,SiPR-Set7干扰组HaCaT细胞PR-Set7蛋白的表达大幅下降;亚砷酸钠染毒组、SiPR-Set7干扰组和联合暴露组HaCaT细胞H4K20me 1蛋白的表达水平均降低,而尾部DNA％及尾矩均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与亚砷酸钠染毒组比较,联合暴露组HaCaT细胞PR-Set7蛋白和mRNA以及H4K20me1蛋白的表达均降低,而HaCaT细胞尾部DNA％及尾矩均升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在对HaCaT细胞进行PR-Set7干扰后,亚砷酸钠可能通过抑制组蛋白甲基转移酶PR-Set7蛋白及mRNA的表达水平,从而降低H4K20me1的修饰水平,影响HaCaT细胞DNA损伤修复能力,使DNA损伤加重.
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组蛋白H4K20甲基化修饰对砷致HaCaT细胞DNA双键断裂损伤的影响
[目的]观察亚砷酸钠(NaAsO2)对人永生化皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)DNA双链断裂损伤、组蛋白H4第20位赖氨酸一、二甲基化(H4K20me1、H4K20me2)修饰水平的影响,探讨H4K20me1、H4K20me2修饰在砷致DNA双键断裂损伤中的作用.[方法]体外常规培养HaCaT细胞,以0.00、1.25、2.50、5.00、10.00 μmol/L NaAsO2连续处理HaCaT细胞24h,10.00 μmol/LNaAsO2处理HaCaT细胞0、6、12、24h,其中以0.00 μmol/L浓度组和0h为空白对照组.采用中性单细胞凝胶电泳法检测各组HaCaT细胞DNA双链断裂损伤水平(尾部DNA百分含量、Olive尾矩);免疫印迹法检测各组H4K20me1、H4K20me2蛋白表达水平.[结果] HaCaT细胞染砷24h后,DNA双链断裂程度在5.00、10.00 μmol/L浓度组高于对照组(P＜0.05);H4K20me1/me2蛋白表达水平在2.50、5.00、10.00 μmol/L浓度组低于对照组(P＜0.05).10.00 μmol/LNaAsO2处理HaCaT细胞0、6、12和24h后,DNA双链断裂程度在12、24h染砷组高于对照组(P＜0.05),H4K20me1、H4K20me2蛋白表达水平在6、12、24h较对照组降低(P＜0.05).尾部DNA百分含量与H4K20me1、H4K20me2修饰水平呈负相关(r=-0.955、-0.855,均P＜0.05),Olive尾矩与二者亦呈负相关(r=-0.940、-0.841,均P＜0.05).[结论]砷可导致HaCaT细胞DNA双键断裂损伤和H4K20me1、H4K20me2表达改变,提示砷所致DNA损伤可能与组蛋白H4K20甲基化修饰有关.
