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血清饥饿对大鼠椎间盘髓核细胞凋亡的影响及其机制研究
目的 研究血清饥饿对大鼠椎间盘髓核细胞凋亡的影响及其可能机制.方法 培养大鼠原代腰椎间盘髓核细胞,取2代细胞进行实验,分为血清饥饿组和正常对照组.血清饥饿组培养基为DMEM,无血清培养24h.正常对照组培养基为10％胎牛血清+DMEM,余培养条件同血清饥饿组.CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞活性;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测细胞凋亡;免疫细胞化学法检测p38MAPK、cleaved Caspase-3蛋白表达;RT-PCR(reverse transcription-PCR)检测Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA、p38MAPK mRNA的表达.结果 血清饥饿组与对照组比较:①细胞活性明显下降(P＜0.01);②凋亡率明显增高(P＜0.01);③p38MAPK蛋白阳性表达明显增强,Caspase-3蛋白阳性表达明显增强;④Bcl-2 mRNA表达明显降低,Caspase-3 mRNA表达明显升高,p38MAPK mRNA表达明显升高(P＜0.01).结论 血清饥饿培养可诱导大鼠腰椎间盘髓核细胞发生凋亡,其发生机制可能与p38MAPK通路下调Bcl-2,激活Caspase-3有关.
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多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞
背景:椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大.目的:探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法.方法:取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较.结果与结论:椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别.说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定.
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椎间盘髓核细胞应力模型中Piezo1蛋白的表达
目的 探讨新型机械激活性离子通道Piezo1蛋白在人椎间盘髓核细胞应力模型中的表达.方法 将人椎间盘髓核细胞分成牵张应力组和牵张应力+Piezo1蛋白抑制剂组,构建人椎间盘髓核细胞体外培养-应力刺激模型,采用多通道细胞牵张应力加载系统FX-4000T处理髓核细胞,两组均加载0、2、12、24、48 h的周期性牵张应力.采用RT-PCR、Western-blot技术检测两组Piezo1的表达水平,应用激光共聚焦显微镜检测Piezo1蛋白荧光的强弱.结果 RT-PCR结果显示,牵张应力组给予2h周期性牵张应力时,Piezo1 mRNA表达较给予0h周期性牵张应力时增加,给予24 h周期性牵张应力时Piezo1 mRNA表达高于其他牵张应力作用时,而给予48 h周期性牵张应力时较给予24 h周期性牵张应力时降低,差异有显著性(F=13.917,P＜0.05).Western-blot结果显示,牵张应力组给予2h周期性牵张应力时Piezo1蛋白表达较给予0h周期性牵张应力时略有增加,给予24 h周期性牵张应力时Piezo1蛋白表达高于其他各组,而给予48 h周期性牵张应力时Piezo1蛋白表达较给予24 h周期性牵张应力时降低,差异有显著性(F=12.781,P＜0.05).牵张应力+Piezo1蛋白抑制剂组Piezo1 mRNA及其蛋白表达均明显小于牵张应力组.Piezo1蛋白表达于髓核细胞的细胞质与细胞核,荧光较强.结论 人椎间盘髓核细胞中Piezo1蛋白稳定表达,并且与应力加载时间相关.
