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△133p53异构体在内质网应激诱导自噬促进细胞凋亡的机制研究
目的 研究p53异构体Δ133p53在内质网应激诱导细胞凋亡过程中的作用,探讨其对自噬的调节.方法 应用p53缺失型1299细胞和Δ133p53 1299细胞为模型,利用Tunicamycin (20 μ,g/ml)诱导的内质网应激导致细胞凋亡；采用免疫荧光方法分别进行凋亡蛋白M30检测以及采用活细胞染料acetoxymethyl(AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)对活细胞/死细胞检测以评价细胞凋亡.转染GFP-LC3质粒并通过自噬体点状结构计数以及Real-time PCR方法检测自噬相关基因的表达检测细胞自噬体的形成.结果 在内质网应激条件下,Δ133p53 1299细胞比1299(p53-/-)对细胞凋亡的诱导更加敏感.与1299(p53-/-)细胞相比,在Tunicamycin诱导下,在Δ133p53 1299细胞中,凋亡蛋白M30高表达并且死细胞数量明显增多.在对自噬的调节方面,在内质网应激条件下,Δ133p53显著提高细胞自噬的形成.与1299(p53-/-)细胞相比,Δ133p53 1299细胞中自噬体点状结构计数增加较多,并且自噬相关基因ATG5的表达显著上调.结论 在内质网应激诱导细胞凋亡过程中,Δ133p53通过诱导细胞自噬而促进细胞凋亡.
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PDTC对胃癌细胞MKN-45p53异构体表达的影响及其生物学意义
[目的]探讨核因子-κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)对胃癌细胞MKN-45 p53异构体表达的影响及其生物学意义.[方法]不同浓度的PDTC (25,50、751,μmol/L)单独及联合顺铂(4μg/ml)作用于胃癌细胞MKN-45,采用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖抑制率;实时荧光定量多聚酶链反应(RT-PCR)检测p53β、△133p53及NF-κBp65在mRNA水平的表达情况.[结果]CCK-8结果显示,PDTC(25、50、75μmol/L)单独作用时能抑制MKN-45细胞生长,抑制率分别为4.95％、12.20％、21.28％,差异有统计学意义(P＜0.0001);当与顺铂(4μg/ml)联合时,MKN-45细胞增殖抑制率随PDTC浓度的增加而增加,且高于单独顺铂组,差异有统计学意义(P＜o.oo1).RT-PCR结果显示,当用不同浓度PDTC (25、50、75μ,mol/L)预处理2h后再加入顺铂(4μg/ml),MKN-45细胞中p53β mRNA的表达差异无统计学意义(P=0.04),而△133p53和p65 mRNA的表达随PDTC浓度的增加而降低,且低于顺铂单独组,差异有统计学意义(P＜0.0001).Pearson相关性分析显示,p65与p53βmRNA表达无相关性(r=0.072,P=0.798),p65与△133p53 mRNA表达呈正相关(r=0.814,P＜0.0001).[结论] NF-κB抑制剂PDTC可以抑制MKN-45细胞的生长,也可以增强顺铂对该细胞的生长抑制效应,△133p53异构体可能是NF-κB-p53对话的关键分子.
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rmhTNF对△133p53表达阳性胃癌细胞系MKN45的影响
[目的]利用rmhTNF-MKN45细胞模型,观察p53异构体△133p53及p53下游基因的表达.[方法]不同浓度(50、100、200、400、500IU/ml)重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)作用应用于MKN45,采用CCK-8法,观察其细胞增殖抑制率;通过巢式逆转录多聚酶链反应(nRT-PCR法)检测△133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1 mRNA的表达变化.[结果]随rmhTNF作用浓度增加和作用时间(24、48、72h)延长,MKN45细胞抑制率明显增加(F=35.683,P＜0.001;F=60.328,P＜0.001).随rmhTNF浓度增加,MKN45细胞中,p53、Gadd45α、PTEN、Bax基因表达上调,△133p53、Mdm2、CyclinB1基因表达下调.△133p53与p53、Gadd45α、PTEN、Bax表达呈负相关(r=-0.916,-0.894,-0.872,-0.971,P均＜0.01),与Mdm2、CyclinB1表达呈正相关(r=0.924,0.943,P均＜0.01).[结论]在肿瘤生长抑制效应中,△133p53异构体表现出与野生型p53拮抗作用,其机制可能与调控Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1等下游基因表达有关.
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肿瘤坏死因子对不同分化程度胃癌细胞增殖及△133p53表达的影响
[目的]探讨肿瘤坏死因子(rmhTNF)对低分化人胃癌细胞株MKN45和中分化人胃癌细胞株SGC7901细胞增殖及对细胞中p53异构体△133p53表达的影响.[方法]不同浓度注射用重组结构人rmhTNF(0、50IU/ml、100IU/ml、500 IU/ml)作用于人胃癌细胞株MKN45和SGC7901.采用CCK8法检测细胞增殖抑制率;巢式逆转录多聚酶链反应(nRT-PCR)检测△133p53及下游分子PTEN在mRNA水平的表达情况.Pearson直线相关分析△133p53与PTEN mRNA表达的相关性.[结果]CCK8法结果显示,rmhTNF对MKN45胃癌细胞株的生长有显著的增殖抑制作用(H=15.434,P=-0.001),实验组细胞(50IU/ml、100IU/ml、500 IU/ml)的增殖抑制率分别为26.2％,33.62％,48.49％.rmhTNF对SGC7901胃癌细胞株的生长无明显增殖抑制作用,实验组细胞的增殖抑制率分别为4.02％,4.63％和2.68％.nRT-PCR结果显示,随rmhTNF浓度的增加,MKN45胃癌细胞株中△133p53在mRNA水平的相对表达量减少,PTEN的相对表达量增加,差异均有统计学意义(H=10.385,P=0.016).SGC7901胃癌细胞株中无△133p53表达,PTEN的表达不随rmhTNF浓度的变化而变化.MKN45胃癌细胞株中△133p53与PTEN的表达呈负相关(r=-0.958,P＜0.01). [结论]rmhTNF对胃癌细胞的抑制作用与△133p53异构体参与的TNF-NF-κB和p53-PTEN信号传导途径的交互作用有关,提示△133p53异构体可能是胃癌分子诊断和生物学治疗的重要靶分子之一.
