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高效液相色谱法测定大鼠肝微粒体CYP3A酶的活性
目的 以咪达唑仑为探针药用HPLC法测定大鼠肝微粒体CYP3A酶活性.方法 用ZORBAX SB-C18色谱柱分离；流动相为乙腈-水-0.1％三氟乙酸；流速为1 mL· min-1；柱温40℃；检测波长为230 nm.肝微粒体加入咪达唑仑孵育5 min后,用乙腈终止反应,加入内标溶液50 μL,混匀后离心10 min,取上清进行HPLC分析；计算Km和Vmax.结果 1-羟基咪达唑仑浓度在0.06～3.00 mg· L-1内线性关系良好；日内、日间精密度均＜10％,回收率＞75％.咪达唑仑羟化反应的Km =7.32μmol· L-,Vmax=0.59 nmol·min-1·mg-1 pro.结论 本方法稳定可靠,能准确反映CYP3A酶的活性.
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HPLC法测定人肝微粒体6β-羟基睾酮和1-羟基咪达唑仑浓度
目的 建立和验证人肝微粒体中CYP3A4探药代谢物6β-羟基睾酮和1-羟基咪达唑仑的测定方法,以准确体外评价CYP3A4的活性.方法 在人肝微粒体温孵系统中加入睾酮37℃温孵生成6β-羟基睾酮,经过碱化后用乙酸乙酯提取微粒体样本,采用Phenomenex Gemina C18分离,流动相由甲醇和水组成,梯度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长245 nm,测定微粒体中6β-羟基睾酮浓度;或人肝微粒体温孵系统中加入咪达唑仑,37℃温孵生成1-羟基咪达唑仑,经过乙腈处理人肝微粒体样本,采用Diamosil C18分离,20 mmoL·L-1醋酸铵-乙腈(60:40,V/V)流动相等度洗脱,流速1.0 mL·min-1,检测波长254 nm,测定1-羟基咪达唑仑浓度.结果 6β-羟基睾酮线性范围为0.111～8.90 mg·L～1,1-羟基咪达唑仑线性范围为20～1 000mg·L-1,两代谢物的批内、批间差异<15%,准确度为85%～115%.结论 建立的测定微粒体中6β-羟基睾酮和1-羟基咪达唑仑浓度的方法符合生物样品测定的要求,能准确测定微粒体中目标物浓度,可用于评价CYp3A4的活性.
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绿豆衣提取物对大鼠肝微粒体CYP3 A4活性的影响
目的:研究绿豆衣提取物(MBSC)对大鼠肝微粒体中细胞色素P450(CYP)3A4酶活性的影响.方法:采用高效液相色谱法,以咪达唑仑为CYP3A4探针药物,建立检测咪达唑仑代谢产物1-羟基咪达唑仑在大鼠肝微粒体孵育体系中浓度的方法,对体外肝微粒体孵育体系中孵育时间、肝微粒体量、孵育时间进行优化,以优化后的条件先后评价绿豆衣提取物对CYP3A4活性的影响及其潜在作用机制.结果:MBSC初提物可显著抑制CYP3A4酶活性,其活性仅为对照组的38.14%(P<0.05),且IC50值为489.7μg·ml-1,抑制机制为竞争-非竞争性抑制.结论:绿豆衣提取物在体外对大鼠CYP3A4酶的活性具有抑制作用,尚需进一步应用体内模型评价其对CYP3A4活性的影响.
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液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中咪达唑仑和奥美拉唑及其代谢产物的浓度
目的:建立人血浆中咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑、奥美拉唑和5-羟基奥美拉唑浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定方法,并将其应用于临床试验中咪达唑仑和奥美拉唑及其代谢产物血药浓度的测定.方法:以地西泮为内标,人血浆样品经醋酸乙酯萃取处理后,进行LC-MS/MS分析.采用Agilent C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-0.015％氨水溶液(甲酸调pH8.20)(80∶20);使用电喷雾离子源(ESI),正离子多反应监测(MRM)模式检测,用于定量分析的咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑、奥美拉唑、5-羟基奥美拉唑浓度和内标地西泮的监测离子分别为m/z:326.4→291.2,m/z:342.2→324.0,m/z:346.1→198.1,m/z:362.2→214.0和m/z:285.2→193.1.结果:咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑、奥美拉唑和5-羟基奥美拉唑在其线性范围内线性关系良好(r均大于0.99),定量下限分别为0.25,0.15,1.00,0.50 ng·ml-1上.批内精密度(RSD)和批间精密度(RSD)均不大于11.05％,提取回收率稳定.结论:本方法特异性强,灵敏度高,测定结果可靠,适用于临床试验中血浆样本的高通量分析.
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氟康唑联用咪达唑仑血药浓度测定方法及相互作用
目的:建立可同时进行氟康唑和咪达唑仑生物样品前处理的方法,应用RP-HPLC法分别测定氟康唑、咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑的血药浓度；同时考察氟康唑与咪达唑仑联用对咪达唑仑血药浓度的影响.方法:1 mL血清样品加入内标后以5 mL乙酸乙酯提取,有机相用氮气吹干,以100 μL甲醇溶解,分别在不同的色谱条件下以20 μL进样测定.结果:氟康唑、咪达唑仑、1-羟基咪达唑仑及内标能够在同一条件下被提取.氟康唑在0.5～20 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.997 0,n=6),咪达唑仑在0.03 ～ 7.29 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.998 5,n=16),1-羟基咪达唑仑在0.09 ～ 7.29 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.999 3,n=5).联用氟康唑和咪达唑仑组较单用咪达唑仑组中咪达唑仑血药浓度明显增高.结论:该法灵敏、准确、简单、快速,可用于同时测定氟康唑、咪达唑仑及其代谢产物的血药浓度.联用氟康唑和咪达唑仑与单用咪达唑仑比较,咪达唑仑血药浓度明显增高.
