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IL-6/JAK/STAT3信号通路抑制剂细胞筛选模型的验证和应用
IL-6/JAK/STAT3是细胞内调节细胞生长、存活和分化的重要信号通路,这条信号通路也控制着T淋巴细胞的分化和激活.IL-6/JAK/STAT3信号通路的异常与自身免疫性疾病和肿瘤密切相关,已经成为药物研发的热门靶点.本研究利用Invivogen公司稳定表达IL-6受体且可与STAT3结合的分泌胚胎碱性磷酸酶(secreted embryonic alkaline phosphatase,SEAP)报告基因的HEK-Blue IL-6细胞,给予IL-6刺激下分泌SEAP,通过与QUANTI-Blue反应,在655nm检测SEAP的生成量,评价化合物对IL-6刺激的STAT3信号通路的抑制作用.结果表明,IL-6可特异性地激活HEK-Blue IL-6细胞.在细胞数为5×104个/孔、1ng·mL-1浓度IL-6刺激20h,并于QUANTI-Blue反应1h时检测OD655吸光度值为佳反应条件.在筛选的14个天然产物中,牛蒡子苷元、隐丹参酮和姜黄素具有很强的抑制STAT3信号通路的活性,IC50值分别为1.28、2.96和6.61μmol·L-1.该HEK-Blue IL-6细胞模型适用于IL-6/JAK/STAT3信号通路抑制剂的筛选.
关键词： 白细胞介素6 双面神激酶 信号转导及转录激活蛋白3 筛选模型 抑制剂 -
人巨细胞病毒通过STAT3上调胶质瘤中endocan表达
本研究旨在探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)和内皮细胞特异性分子1(endocan)在胶质瘤发生发展中的作用及机制.利用HCMV感染人脑胶质瘤U87细胞,检测感染后第1、2、4天信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和endocan的表达变化,并分析HCMV、STAT3和endocan三者之间的可能关联.结果显示,HCMV感染的U87细胞中pSTAT3和endocan表达上调,并随感染时间延长而逐渐升高;用RNAi干扰STAT3基因表达,endocan表达量下降;利用抗病毒药物更昔洛韦抑制HCMV复制后,pSTAT3表达量下降,endocan表达量随之下降.进一步利用免疫组织化学法检测79例脑胶质瘤患者和8例对照者脑组织中pSTAT3表达情况,发现pSTAT3在胶质瘤组织中表达上调;与低级别胶质瘤相比,高级别胶质瘤中pSTAT3染色强度较高.结果提示,HCMV感染可能通过STAT3信号通路上调endocan表达,从而参与胶质瘤的进展.
关键词： 胶质瘤 人巨细胞病毒 内皮细胞特异性分子1 信号转导及转录激活蛋白3 -
可溶性Klotho蛋白抑制高糖诱导的STAT3磷酸化通路减轻肾纤维化
目的:观察可溶性Klotho蛋白对高糖诱导的信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator oftranscription,STAT3)信号通路磷酸化和肾小管上皮细胞纤维化相关基因表达的影响.方法:采用体外培养的HK2肾小管上皮细胞,分别设立高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L)、正常糖对照组(D-葡萄糖5 mmol/L)、高渗透压对照组(D-葡萄糖5 mmol/L+甘露醇25 mmol/L)、Klotho干预高糖组和HO3867(STAT3磷酸化抑制剂)干预高糖组,应用蛋白印迹法、实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,rt-fqPCR)等检测方法分别观察STAT3磷酸化水平变化和肾小管上皮细胞纤维化相关因子的表达水平变化.结果:①rt-fqPCR检测结果表明,与正常糖对照组相比,高糖组HK2细胞内源性Klotho mRNA表达显著下降(P＜0.01),而高渗透压对照组无改变(P＞0.05);②蛋白印迹检测结果表明,与正常糖组相比,高糖可上调HK2细胞内的STAT3磷酸化水平(P＜0.01),而可溶性Klotho蛋白干预可显著抑制高糖引起的STAT3磷酸化激活(P＜0.01);STAT3磷酸化抑制剂(HO3867)干预可显著抑制高糖诱导的STAT3磷酸化水平升高(P＜0.01);③rt-fqPCR检测结果表明,高糖组HK2细胞表达的纤维化相关因子(oα-平滑肌肌动蛋白、Ⅳ型胶原蛋白α1、纤维连接蛋白)较正常糖对照组升高(P＜0.01).Klotho蛋白可抑制高糖诱导的HK2细胞表达纤维化相关因子(α平滑肌肌动蛋白、Ⅳ型胶原蛋白α1、纤维连接蛋白)(P＜0.01).应用STAT3磷酸化抑制剂(HO3867)可部分下调高糖诱导的纤维化相关因子表达(P＜0.01).结论:可溶性Klotho蛋白可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞纤维化,其机制可能是部分通过抑制STAT3磷酸化通路实现的.
关键词： 糖尿病肾病 可溶性Klotho蛋白 信号转导及转录激活蛋白3 肾纤维化 -
IL-6诱导小鼠骨髓中性粒细胞中MMP-9的生成与释放的实验
目的 探讨IL-6诱导小鼠骨髓中性粒细胞(PMN)生成和释放基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用及激活途径.方法 分离小鼠骨髓PMN,将其分为空白对照组、IL-6刺激组、IL-6+DMSO组、IL-6+STAT3抑制剂Ⅷ组.实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞内MMP-9 mRNA表达,明胶酶谱检测PMN释放的MMP-9活性,Western blot检测PMN中STAT3蛋白磷酸化改变.结果 IL-6刺激后,PMN中MMP-9 mRNA水平明显升高(P=0.0050),明胶酶谱检测的释放到胞外MMP-9活性明显高于对照组(P=0.0087),IL-6刺激后PMN中STAT3磷酸化水平明显升高(P=0.0089).在IL-6作用时加入特异性STAT3抑制剂Ⅷ后,MMP-9 mRNA水平、培养上清液中MMP-9活性以及PMN中磷酸化STAT3蛋白水平与IL-6刺激组相比均明显下降(P=0.0067,0.048和0.0098).结论 IL-6刺激骨髓PMN中MMP-9的生成和释放,该作用可能是通过诱导STAT3信号通路磷酸化实现的.
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人参皂甙Rh2对大鼠主动脉STAT3、PCNA及SM22α表达的影响
目的:探讨人参皂甙Rh2(GS-Rh2)对大鼠主动脉信号转导及转录激活蛋白3(STAT3)、增殖细胞核抗原(PCNA)以及血管平滑肌22α蛋白(SM22α)表达的影响.方法:40只6周龄雄性普通级大鼠随机分为正常对照组、阳性对照组、雷帕霉素组、人参皂甙组.正常对照组,正常饮食喂养13周;其余3组高脂饮食喂养13周.13周后,处死大鼠后留取血标本,检测血脂及IL-6,留取主动脉标本,放入液氮罐中保存,提取总蛋白,做Western Blot检测,观察主动脉组织STAT3、PCNA及SM22α表达强度变化.结果:和正常对照组相比,阳性对照组血脂明显增高,血IL-6水平升高,主动脉STAT3、PCNA蛋白表达增加,SM22α蛋白表达减少;和阳性对照组相比,雷帕霉素组、GSRh2组血脂无显著性差异,血IL-6水平下降,主动脉STAT3、PCNA蛋白表达减少,SM22α蛋白表达增加.结论:人参皂甙Rh2可以抑制大鼠主动脉STAT3的表达,可以抑制主动脉平滑肌细胞增殖,并抑制主动脉平滑肌细胞由分化型向合成型转化,GS-Rh2可能通过抑制STAT3的表达而起到抑制平滑肌细胞增殖和表型转化的作用.
