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Stattic对乏氧食管癌细胞放射增敏作用机制的研究
目的 观察Stattic对乏氧人食管癌ECA109细胞的体外放射增敏作用,并探讨其可能机制.方法 应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测Stattic对食管癌ECA109细胞的毒性,细胞克隆形成法确定1.0μmol Stattic对ECA细胞放疗敏感性的影响,流式细胞法检测细胞的凋亡率,γ-H2AX免疫荧光染色法检测不同时间点下ECA109细胞中双键断裂情况,Western blot检测Stattic照射前后STAT3、pSTAT3、HIF-1α、VEGF蛋白的表达.结果 Stattic对ECA109细胞具有毒性,24 hIC50为5.499 μmol/L,克隆形成实验通过单击多靶模型拟合细胞的存活曲线,计算出1.0μmol/L Stattic的放射增敏比SERDo分别为1.20(常氧)和1.28(乏氧),γ-H2AX荧光染色提示Stattic能增加双键断裂情况,尤其是在照射之后0.5h为明显.照射联合给药组的乏氧细胞凋亡率较单独乏氧照射组的细胞凋亡增加(t=7.33,P＜0.05),Western blot显示乏氧食管癌细胞株pSTAT3、乏氧诱导因子1α(HIF-1 α)、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达升高,Stattic作用24 h表达显著下调.结论 Stattic对乏氧人食管癌细胞株ECA109细胞的毒性呈剂量依赖性,放射增敏作用明显,随药物剂量的增加而增强,其机制可能与抑制pSTAT3、HIF-1α和VEGF蛋白表达有关.
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STAT3抑制剂Stattic对肝癌细胞Bel-7402生长、迁移、侵袭和放射敏感性的影响
目的 观察信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抑制剂Stattic(Y705)对人肝癌细胞系Bel-7402的生长、迁移、侵袭和放射敏感性的影响.方法 将人肝癌细胞系Bel-7402分为4组,空白对照组、Stattic组、单纯照射组和Stattic联合照射组(联合组).CCK8检测细胞的生长和增殖;划痕愈合实验和Transwell侵袭实验分别检测各组细胞的迁移能力和侵袭能力;克隆形成实验观察Stattic对Bel-7402细胞放射敏感性的影响;Western blot检测各组STAT3、p-STAT3、Bax,Bcl-2、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平.结果 Stattic明显抑制人肝癌Bel-7402细胞的生长,并表现出剂量-效应关系,Stattic作用于细胞48 h后的IC50为2.5 μmol/L.1.0 μmol/L的Stattic与8 Gy射线照射联用,两者在细胞增殖抑制率上,表现出协同作用,抑制率下降了(15.00±1.87)％(F=63.30,P＜0.05).划痕愈合实验显示联合组细胞的迁移能力明显降低,Transwell侵袭实验显示联合组滤膜细胞数明显减少.克隆形成实验显示,联合组与单纯照射组相比,克隆形成能力下降,SF2、D0、Dq均下降,(=4.20、6.92、9.32,P＜0.05).Stattic在0.5 μmol/L时放射增敏比(SERSF2)为1.22.Western blot结果显示与单纯照射组相比,联合组的p-STAT3、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(=5.32、6.02、13.26,P＜0.05).Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达升高(t=-7.82、-14.09,P＜0.05).Bcl-2蛋白的表达下降(t=18.43,P ＜0.05).结论 Stattic通过抑制肝癌细胞Bel-7402的p-STAT3激活,一方面诱导凋亡增加肿瘤细胞的放射敏感性;另一方面降低了金属基质蛋白酶的上升,从而降低了肿瘤细胞迁移和侵袭能力.
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Stattic抑制STAT3和HIF-1α途径对食管癌裸鼠移植瘤放射敏感性的影响
目的 探讨Stattic对食管癌ECA109细胞裸鼠移植瘤的放射增敏效果及其可能的作用机制.方法 建立食管癌ECA109细胞裸鼠移植瘤模型;移植瘤平均体积增至约150 mm3时,采用随机数表法将24只裸鼠分为4组,药物+照射组(25 mg/kg Stattic+6 Gy)、 单纯药物组(25 mg/kg Stattic)、单纯照射组(6 Gy)、对照组,每组6只.25 d后测量移植瘤体积,计算肿瘤体积抑制率,Western blot法检测移植瘤组织中STAT3、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果 药物+照射组裸鼠移植瘤体积为(705.1±75.5)mm3,显著低于单纯照射组(1113.5±101.4)mm3和单纯药物组(1696.5±100.6)mm3(t=4.35、14.14,P<0.05),其抑制率达(66.1±3.2)％.Western blot检测发现,药物+照射组移植瘤组织中pSTAT3、HIF-1α、VEGF蛋白表达水平较单纯照射组明显降低(t=17.07、5.05、3.54,P<0.05).结论 Stattic对食管癌ECA109细胞裸鼠移植瘤具有放射增敏作用,可能与其抑制pSTAT3、HIF-1α、VEGF途径有关.
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STAT3磷酸化与白塞病临床活动性的关系
目的 通过信号转导及转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化抑制剂Stattic的应用,探讨STAT3磷酸化在白塞病(Behcet's disease,BD)发病机制中的作用及其与BD活动的关系.方法 采集BD活动期(BD-A)、BD缓解期(BD-R)患者各10例和健康对照(HC) 10例的外周血各15 mL,分离获得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC).将各组PBMC分为Stattic抑制剂亚组和空白对照亚组.Stattic抑制剂亚组中加入Stattic 2.5 μmol/L和1 640培养基共5 mL,空白对照亚组仅加1 640培养基5 mL.使用Western blot和流式细胞术检测PBMC中STAT3及其磷酸化(pSTAT3)蛋白质水平;ELISA和RT-PCR分别检测TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白质和mRNA水平.采用双因素方差分析和Bonferroni post hoc test事后检验分析各项检测结果.结果 与健康对照比较,BD患者pSTAT3、STAT3蛋白质水平,TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白质和mRNA水平均升高;与空白对照亚组比较,Stattic抑制剂亚组pSTAT3、STAT3蛋白质水平,TNF-α、IFN-γ、IL-17蛋白质和mRNA水平均降低.BD活动期pSTAT3蛋白质水平,TNF-α、IFN-γ和IL-17蛋白质和mRNA水平均显著高于BD缓解期.结论 STAT3通路激活可能通过介导BD患者TH1、TH17活化而与BD活动性相关.
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抑制STAT3活化对GD2阳性乳腺癌干细胞自我更新能力的影响
目的:探讨选择性STAT3抑制剂Stattic对GD2+乳腺癌干细胞自我更新能力的影响.方法:运用流式细胞仪从乳腺癌细胞系MDA-MB-231中分选GD2+乳腺癌干细胞;采用CCK-8、乳腺球形成实验鉴定GD2+乳腺癌干细胞的增殖、自我更新能力;Western-blot法检测GD2+/GD2-乳腺癌细胞中STAT3、pSTAT3蛋白表达;通过Stattic抑制实验,研究Stattic选择性抑制STAT3对GD2+乳腺癌干细胞自我更新能力的影响作用.结果:接种1000个细胞,GD2+细胞乳腺球形成数目为(22.38±3.44)个,GD2-细胞为(7.14±1.14)个,GD2+细胞形成的乳腺球数目显著大于GD2-细胞的乳腺球数目(P<0.05);GD2+细胞形成乳腺球的大小为(148.47±41.34)μm,GD2-细胞为(57.10±13.58)μm,2组比较差异有统计学意义(P<0.05);从第2天开始,GD2+乳腺癌干细胞增殖速度明显低于GD2-细胞(P<0.05);pSTAT3蛋白在GD2+乳腺癌细胞表达显著高于GD2-乳腺癌细胞(P<0.05),但STAT3表达2组比较差异无统计学意义(P>0.05);选择性STAT3抑制剂Stattic干预GD2+乳腺癌干细胞,其自我更新能力、增殖能力均显著降低(P<0.05).结论:Stattic选择性抑制STAT3可以抑制GD2+乳腺癌干细胞的自我更新能力.
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基于荧光共振能量转移技术的STAT3二聚化抑制剂筛选模型的建立
目的 构建信号传导与转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription factor 3,STAT3)二聚化抑制剂筛选模型,为STAT3抑制剂筛选提供实验方法.方法 分别构建pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告栽体,利用脂质体转染技术将二者共转入HEK-293T细胞,利用ECFP和EYFP2种荧光蛋白之间能量共振转移,检测磷酸化STAT3分子的二聚化水平,并检测Stattic对二聚化的影响.结果 成功构建了pECFP-N1-STAT3和pEYFP-N1-STAT3的荧光报告载体.将2种荧光报告载体共转染HEK-293T细胞后,Western Blot检测结果显示STAT3以及p-STAT3的表达水平明显增加.以458 nm波长激发ECFP,其发射波长可激发EYFP.加入STAT3二聚化抑制剂Stattic后,荧光强度降低,且呈现一定的剂量依赖性.结论 基于荧光共振能量转移技术的STAT3二聚化抑制剂筛选模型构建成功.
